ГОСТ Р ИСО 20395-2023. Национальный стандарт Российской Федерации. Биотехнология. Требования к оценке эффективности методов количественного определения последовательностей нуклеиновых кислот-мишеней. Количественная ПЦР и цифровая ПЦР

6 Метод анализа и оптимизация для количественного определения последовательностей-мишеней нуклеиновой кислоты

6.1 Метод анализа

6.1.1 Общие положения

Требования к количественной оценке РНК и ДНК с помощью методов анализа цПЦР/RT-цПЦР и кПЦР/RT-кПЦР приведены ниже.

Примечание - В [21] также приведено руководство.

6.1.2 Выбор ампликона

Более короткие амликоны, как правило, амплифицируются с большей эффективностью, чем более длинные, но они должны иметь достаточную длину, чтобы в достаточной степени отличаться от возможных первичных димеров при использовании детектирования с помощью флюоресцентного красителя. Рекомендуется ампликон длиной 250 п.о. (bp) или менее для большинства цПЦР- и кПЦР-анализов. Необходимо избегать области, богатые GC, повторяющиеся области и области с общеизвестными SNP, за исключением случаев, когда целью является дифференциальное детектирование SNP [22]. Последовательности между праймерами должны дать результативный и специфический участок для связывания зондом, если используется химическое детектирование с помощью зонда.

Примечание - База данных точечных нуклеотидных полиморфизмов (dbSNP) - это курируемая база данных широко известных SNP в геноме человека. См. [23].

6.1.3 Создание праймера и зонда

Праймеры создают при температуре отжига от 50 °C до 68 °C, и они должны содержать от 40% до 60% содержания GC, при этом у них должны отсутствовать любые значимые вторичные структуры [22]. В оптимальном варианте, расхождение между температурами отжига пары праймеров должно составлять от 1 °C до 2 °C.

Длина зонда должна составлять < 30 оснований. При использовании гидролизуемого зонда температура отжига зонда должна быть не менее чем на 5 °C выше, чем температура праймеров. Кроме того, следует избегать гуанина на 5'-конце зонда из-за возможности гашения сигнала флуоресценции. Температура плавления зонда может быть увеличена за счет использования связующих веществ с малой бороздкой или модифицированных нуклеотидов (таких как закрытые нуклеиновые кислоты).

6.1.4 Оценка специфичности in silico

Анализы ПЦР должны быть разработаны для обеспечения специфичности, а специфичность должна проверяться с помощью компьютерного моделирования (in silico).

Праймеры и зонды ПЦР, предназначенные для целевой последовательности, также могут связываться с аналогичными последовательностями (например, гомологичными генами в пределах одного генома), если последовательности совпадают или отличаются всего на несколько пар оснований от нецелевой мишени. Если область между парой праймеров достаточно мала [< 500 п.о. (bp)], ампликон может быть получен во время ПЦР. В этом случае может случиться так, что анализ не является специфичным для гена-мишени, поскольку нецелевая матрица может способствовать репортерному сигналу, если он присутствует. Добавление зонда в порядок проведения определения может улучшить специфичность.

Чтобы оценить специфичность по отношению к последовательности ампликона-мишени, праймеры и зонды должны быть проверены в сравнении с базой данных эталонов транскриптов или базой данных геномов на наличие необходимых матриц и базой данных (базами данных) возможных загрязняющих матриц (например, используя [24]). В случае идентификации потенциального нецелевого продукта ПЦР при первоначальном скрининге in silico должна быть оценена гомология последовательности зонда с возможным ампликоном, полученным в результате неспецифического связывания пары праймеров (например, с точки зрения числа несоответствий) для информирования о специфичности анализа на основе зонда.

микроРНК (миРНК) часто образуют семейства близкородственных последовательностей, которые могут отличаться только на 1 - 2 п.о. (bp), поэтому специфичность анализа микроРНК (миРНК) должна быть проверена in silico по сравнению с другими членами того же семейства микроРНК (миРНК), чтобы предсказать степень перекрестной реактивности и предоставить информацию для тестирования in vitro (см. 6.2.5). Следует также верифицировать специфичность анализа зрелой микроРНК (миРНК) по сравнению с первичной и исходной формами микроРНК (миРНК).

Примечание - База данных miRBase [25] представляет собой доступную для поиска базу данных опубликованных последовательностей миРНК и аннотаций, которая предоставляет информацию о последовательностях и семействах миРНК. Версии miRBase после miRBase16 могут содержать ложные миРНК, которые были идентифицированы с помощью NGS из-за небольших фрагментов РНК при подготовке библиотеки [26].

6.1.5 Метод RT-кПЦР/RT-цПЦР

Для количественного определения РНК эффект загрязнения gDNA в испытуемой пробе должен быть сведен к минимуму путем выбора областей, которые являются уникальными для последовательности РНК, если это возможно.

Пример - Для мишеней мРНК, которые подвергаются сплайсингу интронных последовательностей, анализ RT-кПЦР или RT-цПЦР может быть разработан с использованием праймеров, которые охватывают экзон-экзонные границы.

Анализ специфичности in silico должен включать поиск BLAST (средство поиска основного локального выравнивания) конкретной эталонной геномной последовательности. Влияние перекрестной реактивности должно быть охарактеризовано во время анализа специфичности (см. 6.2.5) и оптимизации метода с испытуемой пробой (см. 6.3.2).

Для методов RT, в которых для синтеза кДНК используют прайминг на основе олиго-dT, может возникать 3'-смещение из-за фрагментации транскрипта мРНК или снижения процессивности энзима RT по направлению к 5'-концу молекулы. Поэтому следует также учитывать расположение ампликона в транскрипте.

6.2 Оптимизация анализа с использованием очищенных проб

6.2.1 Общие положения

Показатели количественного определения нуклеиновых кислот должны быть оптимизированы. Требования к параметрам метода, которые следует учитывать для получения оптимизированных характеристик анализа, включая выходной сигнал, эффективность и специфичность ПЦР, перечислены ниже.

Анализы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот, можно приобрести у ряда коммерческих поставщиков. Анализы должны быть валидированы каждой лабораторией, прежде чем они будут использоваться в аналитических целях. Заявления поставщиков, касающиеся проведения анализов, должны проверяться на месте, и для получения оптимизированных результатов анализа может потребоваться проведение дополнительных анализов.

Идеальные материалы положительного контроля (см. 4.4) для начальной оптимизации анализа (см. 6.2.2, 6.2.3, 6.2.4) представляют собой простые матричные молекулы (например, плазмиды, олигонуклеотидные конструкции, РНК, транскрибированные in vitro), содержащие только интересующую область-мишень. Оптимизация анализа миРНК может быть выполнена с использованием синтетических олигонуклеотидов РНК той же последовательности. Они дополняют материалы положительного контроля с более сложной нуклеиновой кислотой (например, гДНК, общая РНК из клеточных линий), которые содержат возможные перекрестно-реактивные последовательности (например, псевдогены; изоформы транскриптов), что позволяет оценить специфичность (см. 6.2.5).

6.2.2 Оптимизация сигнала флуоресценции

Первоначальная оптимизация анализа кПЦР или цПЦР должна включать испытание диапазона температур отжига ПЦР, количества циклов ПЦР и концентраций праймеров/зондов для определения оптимальных условий для вывода флуоресцентного сигнала.

В случае цПЦР также требуется оптимизация для минимизации количества ячеек с промежуточной амплитудой флуоресценции (и C_q для систем цПЦР в реальном времени) между отрицательными и положительными кластерами. Разрешение цифрового анализа Rs - это количественный показатель того, насколько хорошо две популяции (положительные и отрицательные) могут быть дифференцированы при линейном разделении. Оно определяется как разница во флуоресценции между двумя пиками, деленная на суммированную ширину пиков. Было предложено разрешение 2,5, чтобы допустить некоторое ухудшение разрешения в более сложных пробах [27].

6.2.3 Эффективность амплификации (RT)-кПЦР

После оптимизации основных параметров анализа (см. 6.2.2) должна быть определена эффективность ПЦР-процедуры измерения, основанной на кПЦР или RT-кПЦР.

Эффективность ПЦР оценивают путем анализа калибровки или серии разведений ДНК (кПЦР) или РНК (RT-кПЦР) во время анализа (см. приложение C). Для RT-кПЦР необходимо выполнить калибровку РНК или серию разведений, поскольку это позволяет провести валидацию одинаковой эффективности RT в применимом линейном диапазоне анализа [28]. Для анализа RT-кПЦР эффективность ПЦР с калибровкой ДНК или серией разведений также может быть проанализирована для сбора информации об эффективности ПЦР-праймеров независимо от этапа RT.

Наклон калибровочной кривой или ряд разведений можно перевести в значение эффективности (см. приложение C). Эффективность (RT)-кПЦР следует оценивать в нескольких определениях (минимум 3) и вычислить доверительный интервал, чтобы оценить прецизионность оценки. При отсутствии помех (см. 6.3.1) средняя эффективность ПЦР должна составлять от 90% до 110% (минус 3,6 >= наклон >= минус 3,1). Степень линейности должна быть охарактеризована коэффициентом корреляции (например, коэффициентом корреляции Пирсона, R). Коэффициент корреляции R² должен быть более 0,99.

Примечание - Теоретически эффективность ПЦР не может превышать 100%, поскольку количество молекул матрицы не может быть увеличено более чем в два раза в каждом цикле. Однако наблюдаемая эффективность ПЦР, вычисленная с помощью регрессионного анализа, может случайно превысить 100%. Если наблюдаемая эффективность ПЦР неоднократно превышает 100%, это может быть связано с присутствием ингибирующих веществ (см. 6.3.1) или артефактом в образцах стандартной кривой или параметрах анализа данных (см. приложение C).

6.2.4 Эффективность RT

Эффективность RT может сильно различаться [29] - [31], поэтому эффективность RT следует оценивать во время оптимизации анализа. Доказательства оптимизации эффективности RT могут включать:

- сравнение альтернативных энзимов/наборов RT [31];

- количественную оценку эффективности RT с использованием транскрибируемых in vitro РНК-матриц [30], [32].

Из-за короткой длины миРНК и киРНК методы, направленные на эти молекулы, обычно включают модифицированную стадию RT, включающую удлинение молекулы миРНК или праймеров "петля-на-стебле", чтобы удлинить последовательность-мишень до длины, подходящей для ПЦР-амплификации. Влияние метода миРНК RT на эффективность RT и специфичность анализа (см. 6.2.5) можно оценить путем сравнения альтернативных подходов во время оптимизации метода.

6.2.5 Специфичность

Должны быть оценены специфичность анализа к предполагаемой мишени и потенциальная перекрестная реактивность с гомологичными последовательностями (например, последовательностями SNP/SNV, псевдогенами, паралогами или ортологами), которые могут присутствовать в типовой биологической пробе. Для анализов, нацеленных на эукариотические геномные области, специфичность RT-кПЦР или RT-цПЦР для предполагаемого транскрипта РНК также следует оценивать путем испытания с использованием пробы гДНК. Специфичность анализа miRNA должна быть проанализирована в отношении синтетических олигонуклеотидов РНК, близкородственных для миРНК. Анализ специфичности праймера/зонда in silico (см. 6.1.4) может дать информацию для испытаний "мокрыми" лабораториями.

Измерения материалов положительного контроля (см. 4.4) следует сравнивать с измерениями аналогичных вводимых количеств близкородственных матриц, которые вероятно будут присутствовать в пробе. Для повышения специфичности анализа может потребоваться изменение температуры отжига ПЦР (см. 6.2.2).

Анализ кривой плавления также может быть выполнен в качестве доказательства специфичности праймера. Анализ кривой плавления представляет собой пост-ПЦР-анализ, выполняемый для оценки специфичности амплифицированных продуктов на основе их характеристик плавления. Реакции, проводимые в присутствии красителей, связывающих двухцепочечную ДНК (дцДНК), инкубируют в диапазоне повышающихся температур. Для детектирования одной последовательности-мишени нуклеиновой кислоты на графике производных должен наблюдаться один пик, что свидетельствует о том, что в реакции был получен один ампликон.

Примечание - Температура плавления (T_m) зависит от длины последовательности ДНК, содержания G:C, буфера и последовательного расположения нуклеотидов.

Для анализа должна быть вычислена доля ложноположительных результатов анализа, выраженная как доля (%) целевой концентрации матрицы или количества на реакцию. Частота ложноположительных результатов необходима для установления предела обнаружения LOD (см. 8.4).

6.3 Оптимизация метода с использованием испытуемых проб

6.3.1 Влияние ПЦР-ингибиторов на матрицу пробы

Пробы нуклеиновой кислоты, содержащие ингибирующие соединения (например, реагенты для приготовления проб, избыточный белок), могут привести к частичному или полному ингибированию последующей ПЦР. На присутствие ПЦР-ингибиторов также могут указывать спорадическая или поздняя амплификация, плохая воспроизводимость и нелинейность калибровочной кривой. Кроме того, в дополнение к оценке основных примесей химических веществ или нуклеиновых кислот, приведенных в 5.4, необходимо оценить влияние матрицы пробы на специфический анализ кПЦР/цПЦР, поскольку наблюдалась различная чувствительность анализов к ингибиторам [33].

Требования для измерения влияния матрицы пробы на показатели анализа и оценки специфического ингибирования ПЦР включают, без ограничения, следующее:

- количественное определение внутреннего контроля ПЦР, несущего последовательность-мишень нуклеиновой кислоты, такой как контрольный ампликон, плазмида, очищенная гДНК. Наличие и степень ингибирования (или усиления) можно определить путем приготовления контрольных реакций, содержащих:

a) внутренний контроль ПЦР, добавленный к экстрагированной матрице пробы;

b) только внутренний контроль ПЦР (т.е. в отсутствие экстрагированной пробы/матрицы);

c) только экстрагированная матрица пробы (т.е. без внутреннего контроля ПЦР) для измерения фоновой концентрации нуклеиновой кислоты-мишени (если она присутствует).

Для проверки статистической значимости с использованием соответствующего испытания (например, t-критерий) необходимо подготовить как минимум три повторения каждой контрольной реакции. При отсутствии модификации результатов анализа матрицей пробы количество целевой нуклеиновой кислоты, измеренное в контрольной пробе 1, равно сумме количеств, измеренных в контрольных пробах 2 и 3, в то время как если анализ ингибируется (или усиливается) матрицей пробы, количество в контрольной пробе 1 будет значительно меньше (или больше), чем сумма количеств, измеренных в контрольных пробах 2 и 3;

- разведение пробы. Поскольку разведение снижает концентрацию потенциальных ингибиторов, ожидаемые кратные расхождения в концентрации или значениях C_q, основанные на разведении, соответствующем наблюдаемым различиям, свидетельствуют об отсутствии ингибирования (или усиления);

- анализ кинетики отдельных реакций [34] и/или расчет эффективности амплификации с использованием серии разведений [35], [36].

6.3.2 Наличие примесей нуклеиновых кислот в испытуемой пробе

Чувствительность анализа RT-кПЦР или RT-цПЦР к загрязнению гДНК (перенесенному с этапа экстракции) должна быть оценена, как описано в 6.1.5 и 6.2.5. Присутствие загрязняющей gDNA в испытуемой пробе следует идентифицировать с помощью RT(-)-контроля (см. 4.4). Следует избегать загрязнения гДНК с помощью использования ДНКазы (DNAse) в процессе подготовки РНК.

Контроль RT(-) не должен показывать амплификации. Однако, если реакции RT(-) дают положительный результат (или наблюдается спорадическая картина обнаружения с долей реакций, генерирующих сигнал), их существование должно быть обосновано, а расхождение в C_q или концентрации между испытуемыми пробами и парным реакциями RT(-) должно быть охарактеризовано. Влияние сигнала гДНК следует учитывать при количественном определении целевой нуклеиновой кислоты и вычислении предела обнаружения LOD-метода (см. 8.4).

6.3.3 Валидированный диапазон измерений

Должен быть описан валидированный диапазон измерений для метода, который охватывает предел обнаружения LOD (см. 8.4), и указан линейный диапазон метода (см. 8.5).

Чтобы установить валидированный диапазон измерения метода, необходимо изучить ответную реакцию эталонных материалов (или, если эталонные материалы недоступны, собственных проб или проб с добавками), концентрации которых перекрывают интересующий диапазон и достигают предельного разведения.

Для количественного определения концентрации с помощью кПЦР с использованием калибровочной кривой (см. 4.2.2) количество целевой нуклеиновой кислоты в испытуемых пробах должно находиться в пределах диапазона концентраций, охватываемого калибровочной кривой.

Для цПЦР валидированный диапазон измерений должен быть указан как диапазон копий на реакцию (или значений лямбда), поскольку среднеквадратическая погрешность оценки концентрации Пуассона (см. 4.2.3) варьируется в зависимости от доли положительных ячеек [37], [38].

6.4 Контроль без матрицы

Все NTC и отрицательные контроли процессов не должны демонстрировать признаков ПЦР-амплификации. Любые неотрицательные результаты (например, праймер-димер для методов с использованием интеркалирующих красителей) должны быть подкреплены доказательствами (например, с использованием анализа кривой плавления в 6.2.5).