ГОСТ Р ИСО 20395-2023. Национальный стандарт Российской Федерации. Биотехнология. Требования к оценке эффективности методов количественного определения последовательностей нуклеиновых кислот-мишеней. Количественная ПЦР и цифровая ПЦР
5 Контроль качества пробы. Количество общей нуклеиновой кислоты, целостность и чистота
5.1 Общие положения
Преаналитические методы и экстракция матрицы специфической нуклеиновой кислоты должны проводиться по необходимости для испытуемой пробы согласно соответствующим стандартам ИСО и руководствам, если применимо (например, серия ИСО 20184 и серия ИСО 20186).
Как правило, следует измерить общую массовую концентрацию нуклеиновой кислоты (обычно выражаемую как нг/мкл или мкг/мл), чтобы обеспечить соответствующую входную пробу на кПЦР или цПЦР, на показатели которой может повлиять вариация матрицы общей нуклеиновой кислоты реакции. Анализ деградированных проб может привести к получению данных низкого качества и неточному количественному определению. Кроме того, присутствие ингибиторов может выборочно повлиять на цПЦР и кПЦР [18].
Чтобы показать, что вводимые данные кПЦР/цПЦР стандартизированы и пробы нуклеиновой кислоты достаточно чистые, концентрированные и не содержат компонентов, которые ингибируют или увеличивают последующую кПЦР или цПЦР, необходимо описать следующие методы для характеристики очищенной пробы нуклеиновой кислоты:
- целостность нуклеиновой кислоты;
- чистоту нуклеиновой кислоты.
Если один из этих шагов или более не применимы или не целесообразны, должны быть указаны причины. Например, в некоторых информационных потоках вводные данные реакции будут нормализованы до входных величин, например, объем биологической жидкости (см. 4.3), а не общее количество нуклеиновой кислоты. Аналогичным образом, если выполняют одноклеточный анализ, количество общей нуклеиновой кислоты слишком маленькое для анализа целостности нуклеиновой кислоты, и анализ чистоты не применяют.
Используемые общие методы измерения концентрации общей нуклеиновой кислоты и оценки ее качества приведены в 5.2 - 5.4 вместе с требованиями к их применению.
5.2 Количественное определение общей нуклеиновой кислоты
5.2.1 Общие положения
Количественное определение общей нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК, сообразно ситуации) может быть выполнено с помощью различных методов, включая ультрафиолетовую спектрофотометрию, флуоресцентный ДНК/РНК-анализ и кПЦР.
Однородность пробы нуклеиновой кислоты - это определяющий фактор в любом методе количественного определения. Проба нуклеиновой кислоты должна быть полностью растворена и тщательно перемешана перед проведением количественного определения. Должна быть предоставлена информация по вариации между дублирующими измерениями одной и той же пробы для типовых проб.
5.2.2 Спектрофотометрия
Нуклеиновые кислоты сильно поглощаются в УФ с максимумом в 260 нм или приблизительно указанному значению, таким образом, их можно количественно оценить путем измерения УФ-поглощения, используя спектрофотометр (см. приложение A). Необходимо учитывать следующие источники систематической погрешности, оказывающие воздействие на данный метод:
- все присутствующие виды нуклеиновых кислот участвуют в поглощении (т.е. ДНК, РНК, короткие олигонуклеотиды и свободные олигонуклеотиды), таким образом можно дать завышенную оценку концентрации интересующей нуклеиновой кислоты (например, ДНК);
- многие химические соединения поглощаются при 260 нм или приблизительно указанному значению (например, фенольные растворы, используемые для выделения или лизиса), тем самым представляя другой потенциальный источник положительной систематической погрешности.
Для того, чтобы результаты определения массовой концентрации прослеживались до СИ, необходима калибровка с помощью сертифицированного стандартного образца с составом, аналогичным составу испытуемой пробы.
5.2.3 Флуорометрия
Использование флуоресцентных красителей для количественного определения общей нуклеиновой кислоты - это альтернативный метод количественной оценки. Флуоресцентные методы зависят от характеристик флуоресценции небольших молекул или красителей при связывании с нуклеиновой кислотой. Необходимо учитывать потенциальные источники систематической погрешности, оказывающие воздействие на флуоресцентные методы, включая:
- состояние денатурации нуклеиновой кислоты;
- деградацию нуклеиновой кислоты, так как некоторые красители преимущественно связываются с молекулами, превышающими определенный размер;
- температуру;
- pH;
- воздействие УФ-света (фотообесцвечивание);
- химические загрязнители, которые могут повлиять на эффективность связывания (необходимо проверить информацию поставщика);
- химические загрязнители, которые вызывают гашение флюоресценции, так как это значительно влияет на флуорометрические показания. Тяжелые ионы, такие как анионы йодина или катионы цезия, а также нейтральные молекулы, такие как акриламиды, могут действовать как гасители.
Измерения связаны с калибровочным материалом или стандартным раствором нуклеиновой кислоты, следовательно, погрешность измерений зависит от точности значения, присвоенного калибровочному материалу, и от сходства состава испытуемой пробы и калибровочного материала. Также необходимо включить оценку положительного и отрицательного контроля.
5.2.4 Оценка концентрации общей ДНК с помощью кПЦР/цПЦР
кПЦР и цПЦР могут использоваться для количественного определения общей ДНК специфического таксономического назначения, например общая ДНК человека, общая бактериальная ДНК, общая грибковая ДНК, путем использования праймеров соответствующей таксономической специфичности в сочетании с преобразованием в массовую концентрацию, используя значение величины генома организма. В соответствии с данным методом измеряют количество амплифицируемой ДНК, не обязательно концентрации общей ДНК в пробе, следовательно, результаты необходимо интерпретировать вместе с информацией по целостности (см. 5.3) и чистоте (см. 5.4) пробы.
К методам, основанным на кПЦР/цПЦР, относительно количественного определения общей ДНК применяют следующие требования:
- специфичность: Должны быть предоставлены данные по специфичности ПЦР-анализа, включая коммерческие ПЦР-анализы. Для видоспецифических праймеров должно быть продемонстрировано отсутствие гомологии с другими видами. Для праймеров и зондов известных последовательностей специфичность необходимо проверять в соответствии с 6.1.4 и 6.2.5;
- метрологическая прослеживаемость: Для прослеживаемого количественного определения общего количества копий гДНК или массовой концентрации, калибровочная кривая должна основываться на эталонном материале, анализированном в отношении массовой концентрации и количества геномных копий на единицу объема. Должен быть указан источник эталонного материала;
- коммутативность калибрующего вещества: Эффективность ПЦР калибрующего вещества должна быть такой же, как эффективность ПЦР анализируемой пробы;
- отсутствие ПЦР-ингибирования: Отсутствие ингибирования в анализируемой пробе (см. 5.4);
- длина ампликона ПЦР-анализа для измерения общей концентрации ДНК должна соответствовать планируемому последующему анализу кПЦР/цПЦР, т.е. быть схожей по длине ампликона или сопровождаться свидетельствами целостности нуклеиновой кислоты.
5.3 Целостность нуклеиновой кислоты
Целостность нуклеиновой кислоты влияет на точность количественного определения специфических последовательностей-мишеней, и должна быть предоставлена информация, относящаяся к целостности пробы.
Методы, обычно используемые для оценки целостности пробы нуклеиновой кислоты с примерами применения, приведены в приложении B. Самые распространенные методы - это гель-электрофорез (капиллярный и блочный) и измерение ампликонов с разными размерами. Необходимо обратить внимание на положительный контроль и калибровочные материалы, используемые для принятия/отбрасывания целостности нуклеиновой кислоты в испытуемой пробе или для количественной оценки ее целостности. Примеры могут включать пробы высокого качества как положительный контроль для гель-электрофореза или интактную матрицу плазмиды для соотношения 5'/3' или анализ ампликонов различных размеров. Кроме того, показатели методов измерения последующих кПЦР или цПЦР с испытуемыми пробами различной целостности необходимо анализировать, чтобы установить критерии целостности нуклеиновой кислоты.
5.4 Чистота нуклеиновой кислоты
Необходимо определить чистоту нуклеиновой кислоты. Это может включать, без ограничения, проверку:
- отсутствия мешающих химических примесей: органический растворитель, компоненты гликана и протеина, переносимые из матрицы пробы или на этапе экстракции;
- отсутствия загрязняющей гДНК в пробе РНК (по желанию на наличие РНК в пробе ДНК).
Могут быть применены различные подходы, включая, без ограничения:
a) УФ-спектрофотометрия. Присутствие потенциально загрязняющих органических веществ можно грубо определить, измерив показатели поглощения при 280 и 230 нм для протеинов, и при 230 нм для хаотропных солей и фенола. Критические параметры - это коэффициент поглощения от 260 до 280 нм и коэффициент поглощения от 260 до 230 нм (см. приложение A). Данный подход ограничен пробами с достаточной концентрацией для количественного определения общей нуклеиновой кислоты с помощью УФ-спектрофотометрии (см. 5.2.2).
b) кПЦР- и цПЦР-анализ с внутренним контролем для ПЦР-амплификации. Увеличение или снижение значения Cq чужеродной молекулы, внесенной в пробу, по сравнению со значением Cq для аналогичного количества чужеродных молекул, внесенных в буферный раствор, указывает на присутствие ингибиторов или усилителей реакции соответственно [19]. Наоборот, для кПЦР-метода, основанного на цПЦР или калибровочной кривой, увеличение или снижение количества копий чужеродной молекулы, внесенной в пробу, по сравнению с количеством копий, измеренным для аналогичного количества чужеродных молекул, внесенных в буферный раствор, указывает на присутствие ингибиторов или усилителей реакции соответственно.
c) Флюорометрический метод с определением специфичности для РНК или ДНК (см. 5.2.3).
d) Контролируемые реакции RT(-) или анализ, нацеленный на гДНК, также подходят для определения загрязнения гДНК в пробе РНК (см. 6.3.2).
Применения методов анализа чистоты нуклеиновой кислоты для ряда клинических препаратов приведены в [20].
Подписаться на обновления