ГОСТ Р ИСО 20395-2023. Национальный стандарт Российской Федерации. Биотехнология. Требования к оценке эффективности методов количественного определения последовательностей нуклеиновых кислот-мишеней. Количественная ПЦР и цифровая ПЦР
4 План проведения определения
4.1 Общие положения
План проведения количественного определения нуклеиновой кислоты должен включать выбор соответствующего типа и количества проб, этапы процесса ауторепродукции, контроль, который необходимо включить, потребность в методе случайного отбора проб и стандартную схему определения. Особые факторы, которые необходимо учитывать, приведены ниже. Оценка прецизионности анализа последовательности-мишени нуклеиновой кислоты на целевом диапазоне испытуемых проб при валидации (см. 8.2) метода анализа должна определять количество воссозданных реакций, выполненных в процессе стандартного анализа.
4.2 Метод количественного определения
4.2.1 Общие положения
Выбор методики количественной оценки будет зависеть от применения. Большая часть методологических подходов, которые можно использовать, а также требования к применению, приведены в 4.2.2 - 4.2.5.
4.2.2 Определение концентрации нуклеиновой кислоты с помощью количественной ПЦР с использованием калибровочной кривой
Калибровочную кривую строят, используя независимые измерительные эталоны с указанными абсолютными и относительными концентрациями [например, концентрация количества копий (копий/мкл), стандарты массового соотношения (г/кг), международная система измерений (СИ)], которые имеют такую же или аналогичную матрицу, что и испытуемые пробы.
Расхождение результатов калибровочной кривой должно отражать неопределенность измерений и распространяться на оценку неопределенности концентраций испытуемой пробы.
Если анализируют РНК, калибровочный стандарт должен содержать РНК и должен пройти такую же предварительную обработку, что и испытуемые пробы, т.е. включая этап обратной транскрипции. Если анализируют кольцевую ДНК, ее необходимо привести к линейному виду для исключения любой сверхспирализации. Если испытуемая проба - это одноцепочечная ДНК (оцДНК) (например, кДНК), то стандарты измерения должны либо представлять собой одноцепочечную ДНК, либо формулу калибровочной кривой необходимо изменить, чтобы отразить разницу в 1 единицу Cq, так как матрица оцДНК не амплифицируется в первом цикле ПЦР [2].
Калибровочные растворы должны быть равномерно распределены по диапазону концентраций, и предпочтительно выходить за его пределы [3]. Необходимо использовать минимум пять различных концентраций, каждая как минимум в двух экземплярах.
Концентрации испытуемых проб оценивают по калибровочной кривой. Концентрацию ci вычисляют по формуле
, (1)
где Cq - Cq испытуемой пробы;
a - отрезок на калибровочной кривой;
b - наклон.
Примечание - "Абсолютное количественное определение" зачастую используется производителями оборудования в отношении оценки концентраций неизвестных проб с помощью калибровочной кривой. Это использование термина "абсолютное количественное определение" неправильное, так как калибровочную кривую строят с помощью калибровочных растворов известных концентраций.
4.2.3 Определение концентрации количества копий с помощью цПЦР с использованием подсчета молекул
цПЦР - это конечное измерение, которое дает возможность определить количество последовательностей-мишеней нуклеиновой кислоты без использования калибровочной кривой. Смесь цПЦР, содержащая испытуемый раствор, произвольно распределяется в отдельные ячейки номинально равного объема таким образом, чтобы некоторые ячейки не содержали матрицы нуклеиновой кислоты, а другие содержали одну или более матричных копий. Ячейки подвергаются термическому циклу до конечной точки, а затем считываются, чтобы определить фракции ячеек с положительной реакцией. Необходимо использовать статистику Пуассона [4] для оценки количества копий ДНК-мишени.
Среднее количество копий на ячейку 
вычисляют по формуле
, (2)
где NP - количество положительных ячеек;
NT - общее количество ячеек.
Концентрацию количества копий (копии мкл-1) в цПЦР (CцПЦР mix) вычисляют по формуле
, (3)
где VP - средний объем ячейки, нл.
Объем ячейки, используемый в вычислении концентрации количества копий, должен основываться на эмпирических измерениях, выполненных при валидации оборудования или основанных на опубликованных отчетах, а неопределенность измерений объема ячейки должна быть отражена в суммарной неопределенности измерения концентрации количества копий (см. 10.4).
Если смесь цПЦР и предшествующие разведенные растворы испытуемых проб были приготовлены по объему, концентрацию количества копий (копии мкл-1) в испытуемом растворе C вычисляют по формуле
, (4)
где D - фактор разведения по объему из испытуемого раствора в смесь цПЦР.
Если смесь цПЦР и предшествующие разведенные растворы испытуемых проб были приготовлены по массе, концентрацию количества копий (копии мкл-1) в испытуемом растворе C вычисляют по формуле по сравнению с приготовлением по объему
, (5)
где 
- плотность испытуемого раствора, мг/мкл;
- плотность смеси цПЦР, мг/мкл;
m - масса испытуемого раствора, мг;
mцПЦР premix - масса предварительно приготовленной смеси ПЦР, мг.
Если матрица одноцепочечная, расчетная концентрация числа копий в испытуемом растворе означает концентрацию числа копий одноцепочечной матрицы. Если матрица включает конкатемер или тандемный повтор последовательности-мишени, матрицу необходимо дигерировать энзимом, имеющим участок рестрикции между последовательностями-мишенями, а не в пределах последовательности-мишени. Этап дигерирования необходим, чтобы все последовательности-мишени были независимыми и могли случайным образом распределиться в процессе разделения. Недостаточное дигерирование приведет к заниженной оценке концентрации количества копий мишени.
4.2.4 Относительное количественное определение с помощью кПЦР
Количественное определение нуклеиновой кислоты с помощью данных кПЦР, основанных на значениях Cq, без использования калибровочной кривой часто называют "относительным количественным определением". Так как значения Cq - это логарифмические величины, значение дельта Cq фактически выражает измерение отношений между двумя значениями величины.
Первичные значения дельта Cq, вычисленные во время анализа, должны основываться на значениях Cq двух проб, измеренных в одной и той же ПЦР. Не рекомендуется, чтобы первичные вычисления дельта Cq основывались на значениях Cq двух ПЦР-анализов для одной и той же пробы, так как значения Cq не имеют отношение друг к другу с точки зрения количества мишеней и характеристик независимой амплификации и пороговые значения различных ПЦР-анализов делают невоспроизводимым прямое сравнение [1]. Кроме того, вычисление значений дельта Cq, основанное на двух пробах, позволяет провести конвертацию в линейную шкалу (обычно называемые относительными величинами), чтобы учесть эффективность ПЦР (см. 6.2.3), по формуле (см. [5])
, (6)
где E - эффективность ПЦР;
- значение дельта Cq.
Из-за отсутствия калибровочной кривой сравнение данных различных исследований требует включения межпланшетного калибратора или эталонной пробы, включенной в каждый планшет, чтобы нормализовать расхождения в установках пороговых значений [7].
Для измерений вариации числа копий с помощью количественной ПЦР, при условии, что амплификацию гена или делецию сравнивают с эталонным геном [7], требуется эталонная проба с известным соотношением 1:1, чтобы нормализовать возможные расхождения в эффективности количественной ПЦР между двумя ПЦР анализами.
Кроме того, процедуры измерения с помощью количественной ПЦР, применяющие методику относительной количественной оценки, должны включать дополнительную независимую эталонную пробу или эталонный контроль материала по каждому планшету количественной ПЦР, чтобы контролировать воспроизводимость метода количественного определения со временем, а также, в отличие от использования калибровочной кривой (см. 4.2.2), калибратор с независимо присвоенным значением отсутствует, и эффективность ПЦР не измеряют в каждом анализе.
Если статистическая обработка, включая предоставление доверительных интервалов или расширенную неопределенность измерений, основывается на допущении распределения, соответствующее допущение необходимо проверить на правильность. Такие проверки могут включать, например, статистическую проверку отклонения от предполагаемого распределения или проверку графика квантиль-квантиль. Необходимо сгенерировать как минимум 30 независимых единиц данных для любой проверки допущений по распределению.
Пример - Допущение нормальности необходимо проверить с помощью критерия Шапиро-Уилка или с помощью графика нормальной вероятности.
Примечание - Проверка допущений распределения не устанавливает доказательство определенного распределения. Скорее, она указывает на то, что отклонения от предполагаемого распределения не настолько большие, чтобы вызвать серьезное беспокойство относительно определенного набора данных.
Если статистический анализ выполняют с использованием логарифмически преобразованных данных, доверительные интервалы и неопределенности измерений должны регистрироваться на той же шкале. Если логарифмически преобразованные данные преобразовывают в линейную шкалу, доверительные интервалы и неопределенности измерений необходимо вычислить [8] или предоставить доказательство того, что симметричная аппроксимация доверительного интервала на линейной шкале достаточная для покрытия самого большого из двух асимметричных доверительных интервалов.
4.2.5 Определение отношения между двумя мишенями с помощью цПЦР
Для определения отношения (R) между мишенью A и мишенью B в одном и том же испытуемом растворе можно использовать двойной анализ цПЦР. При проведении исследования в условиях двойного анализа коэффициенты для объема, массы, плотности и разбавления исключают для двух мишеней, и в результате для измерения вычисляют по формуле
, (7)
где NP Target A - количество положительных ячеек для мишени A;
NP Target B - количество положительных ячеек для мишени B.
Более подробное руководство по величинам коэффициентов, основанным на цПЦР, приведено в [4], [7].
4.3 Метод нормализации
Методы количественной оценки, применяющие нормализацию, должны демонстрировать, что методика нормализации подходящая.
Нормализация должна минимизировать воздействие технической вариации, или "шума", чтобы способствовать определению истинной биологической вариации.
В [9] указано о систематической погрешности амплификации микроРНК (миРНК) в количественном определении, основанном на кПЦР. Это необходимо учитывать для результатов измерений нормализации микроРНК (миРНК).
Нормализация вводит поправку на коэффициенты, влияющие на пробу в целом вместо того, чтобы являться специфической для мишени нуклеиновой кислоты, и, тем самым, избегает источников искаженного измерения неспецифической вариации требуемого гена. Технические коэффициенты, контролируемые с помощью метода эффективной нормализации, включают изменчивость элементов выборки, порчу пробы при транспортировании и хранении, и выход экстракции нуклеиновой кислоты и обратную транскрипцию.
Так как нормализацию обычно применяют к значениям Cq кПЦР, нормализации могут подвергаться как значения Cq, так и значения количества копий.
Существует множество методов нормализации технических расхождений, которые могут подойти для анализа ДНК или матричной РНК (мРНК) (экспрессия гена) [10]. Более подробное руководство по методам специфической нормализации приведено ниже.
a) Нормализация эталонных генов. Для количественной оценки геномной ДНК (гДНК), данные могут быть нормализованы к одному или более эталонным генам. Необходимо оценить много геномных локусов, чтобы убедиться, что выбранный маркер является репрезентативным для количества геномных копий [11]. Используемый(е) эталонный(е) ген(ы) необходимо оценить в части их стабильности в типах пробы.
b) Нормализация уровня экспрессии эталонных генов. Для исследования экспрессии генов целевое количество должно быть нормализовано к множественным эталонным генам в силу возможной изменчивой экспрессии в одном эталонном гене и последующей систематической погрешности в анализе GOI [1]. Эталонные гены для измерения мРНК и экспрессии миРНК должны быть эмпирически проверены в экспериментальных условиях и на типах проб, к которым применяют данный метод измерения. Можно использовать статистику для определения оптимального количества эталонных генов для нормализации [12] - [14].
c) Нормализацию уровня экспрессии всех исследуемых генов часто называют глобальной нормализацией. Этот вариант можно использовать, когда нельзя идентифицировать стабильные гены для использования в качестве эталонных (как в некоторых случаях измерения экспрессии миРНК [15] и исследованиях экспрессии одноклеточного гена), при условии, что измерено достаточно большое общее количество мишеней. Количество мишеней, необходимых для глобальной нормализации, должно быть оценено [16].
d) Нормализация количества используемого материала, в случаях, когда результат метода измерения, основанного на кПЦР или цПЦР, заявлен для определенной входной величины. Подходящие примеры - это количество клеток, объем крови или общее количество РНК. Для определенных применений, таких как основанных лишь на нескольких клетках, где экспрессия - стохастическая и входное количество определено независимо (например, с помощью микроскопирования), этот метод лучше, чем нормализация эталонных генов [17].
4.4 Контроль
К методу кПЦР или цПЦР должен применяться надлежащий контроль для оценки общего количества и надежности вырабатываемых данных. Вид контроля должен точно отражать испытуемые пробы. Методы должны устанавливать положительный и отрицательный контроль, включенный в каждый аналитический анализ. Примеры соответствующего контроля приведены в таблице 1.
Таблица 1
Положительный и отрицательный контроль для методов
количественного определения целевых нуклеиновых кислот
Тип контроля | Наименование контроля | Типовой состав | Причина включения |
Отрицательный | NTC | Реакция, содержащая воду или буферный раствор вместо матрицы нуклеиновой кислоты | Детектирование загрязнения измерения на этапе установки реакции (кПЦР/цПЦР для анализа ДНК; RT-кПЦР/цПЦР или RT для одно- или двухэтапного анализа ДНК или РНК, соответственно). Детектирование нежелательных продуктов амплификации, таких как амплифицированные первичные димеры, которые могут встречаться при использовании связывающих красителей дцДНК |
Отрицательный | Холостая проба для экстракции | Экстракция, содержащая воду или буферный раствор вместо испытуемой пробы | Контроль, осуществляемый вместе с испытуемой пробой, чтобы детектировать загрязнение на этапе экстракции |
Отрицательный | RT(-) | Реакция RT без добавления энзима RT | Амплификация гДНК (для анализа мРНК) |
Отрицательный | Специфичность | Матричная проба или контроль гДНК, не содержащий целевую матрицу | Характеристика и контроль доли ложноположительных результатов (например, 100%-ный дикий тип гДНК для количественной оценки SNV; немодифицированная разновидность для испытания ГМО) |
Положительный | Количественная оценка | Хорошо изученный биологический материал или раствор нуклеиновой кислоты | Количественная оценка функциональности компонентов реакции и оценка эффективности ПЦР-анализа. Оценка специфичности реакции для анализа генотипа с помощью анализа кривой плавления постамплификации |
Положительный | Количественная оценка | Хорошо изученный биологический материал или раствор нуклеиновой кислоты | В качестве количественного положительного контроля; также оценка количественных результатов измерения или калибровки |
Положительный | Внутренний положительный контроль | Холостая проба или матрица с добавлением чужеродной матрицы | Подтверждение того, что не имело место ингибирование реакции (контроль качества для ложноотрицательных результатов) |
Примечание - Категории контроля приведены в ИСО 24276. | |||
Отрицательный контроль должен включаться наряду с испытуемыми пробами, чтобы и к установочному контролю ПЦР, и отрицательному контролю применялись одни и тем же методы экстракции и подготовки, что и к анализируемой пробе. Необходимо включить количество отрицательных контролей, а их подготовка должна перемежаться с подготовкой испытуемых проб, чтобы получить репрезентативную оценку уровня загрязнения в процессе анализа. Для методов RT-кПЦР или RT-цПЦР, отрицательный контроль должен включать RT(-)-контроль, содержащий пробы положительной РНК, которые были обработаны с помощью метода выделения РНК, который необходимо применять к испытуемым пробам.
Если применимо, чистота последовательности нуклеиновой кислоты материала положительного контроля должна проверяться с помощью глубокого секвенирования. Для материала положительного контроля, используемого для калибровки, должен указываться метод, с помощью которого определены значения величины.
Подписаться на обновления