ГОСТ Р ИСО 20395-2023. Национальный стандарт Российской Федерации. Биотехнология. Требования к оценке эффективности методов количественного определения последовательностей нуклеиновых кислот-мишеней. Количественная ПЦР и цифровая ПЦР

3 Термины и определения

 

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями.

ИСО и МЭК ведут терминологические базы данных для использования в области стандартизации по следующим адресам:

- платформа онлайн-просмотра ИСО: доступна по адресу: http://www.iso.org/obp;

- Электропедия МЭК: доступна по адресу: http://www.electropedia.org/.

3.1 ампликон (amplicon): Особый фрагмент ДНК или РНК, который является продуктом технологии амплификации ДНК, таким как цепная реакция полимеризации (ПЦР).

[ИСО 13495:2013, 3.3.1]

3.2 график амплификации (amplification plot): Графическое изображение генерации сигнала репортера (как правило, флуоресцентного) во время реакции кПЦР или цПЦР

Примечание 1 - Для систем кПЦР и некоторых систем цПЦР график амплификации показывает взаимоотношение между номером цикла (ось x) и флуоресцентным сигналом (ось y).

Примечание 2 - Для конечной точки цПЦР отображается флуоресцентный сигнал каждого разделения цПЦР. Для одного флуорофора одномерный график амплификации показывает число разделений (ось x) против конечного флуоресцентного сигнала (ось y). Многомерный график амплификации показывает флуоресцентный сигнал для каждого канала детектора на каждой оси.

 

3.3 калибровочная кривая; градуировочная кривая (calibration curve; standard curve): Выражение соотношения между показанием и соответствующим измеренным значением величины.

[Руководство ИСО/МЭК 99:2007, 4.31, изменено - примечания исключены]

3.4 калибратор (calibrator): Эталон, используемый при калибровке.

Примечание 1 - Термин "калибратор" используют только в определенных областях.

 

Пример - Пробу межпланшетного калибратора для кПЦР часто включают в каждый планшет для кПЦР в исследовании, включающем несколько планшетов для кПЦР или экспериментах, чтобы компенсировать отклонения между планшетами из-за факторов измерения приборов, таких как установки базовой линии и пороговых значений. Межпланшетный калибратор содержит целевую(ые) последовательность(и), выявляемую(ые) при ПЦР-анализе и измеренную(ые) с помощью того ПЦР-метода, что и анализируемые пробы.

[Руководство ИСО/МЭК 99:2007, 5.12, изменено - добавлен пример]

3.5 комплементарная ДНК; кДНК (complementary DNA; cDNA): Одноцепочечная ДНК, комплементарная для данной РНК и синтезированная в присутствии обратной транскриптазы для использования в качестве матрицы для ДНК амплификации.

3.6 число копий (copy number): Количество молекул (копий), содержащих определенную последовательность нуклеиновой кислоты.

[ИСО 16577:2016, 3.28, изменено - "ДНК последовательности" заменено на "содержащих определенную последовательность нуклеиновой кислоты"]

3.7 концентрация числа копий (copy number concentration): Количество молекул (копий), содержащих определенную последовательность нуклеиновой кислоты в определенном объеме.

3.8 цикл количественного определения C_q (quantification cycle C_q): <кПЦР> цикл, при котором флуоресценция от реакции пересекает определенное пороговое значение, при котором сигнал может быть отделен от фоновых значений.

Примечание 1 - Цикл количественного определения - это общий термин, который включает пороговое значение цикла (C_t), точку пересечения (C_p), точку отсчета и все остальные специальные термины приборов, относящиеся к дробному циклу, используемые для количественного определения концентрации мишеней в анализе кПЦР.

Примечание 2 - Цикл количественного определения основывается либо на пороговых значениях, применяемых ко всем пробам, либо на регрессионном анализе сигнала, для каждой пробы.

 

[ИСО 16577:2016, 3,32 изменено в соответствии с Руководством MIQE [1] - добавлены примечания 1 и 2]

3.9 дельта C_q; (delta C_q; ): Разница между двумя значениями .

3.10 цифровая ПЦР; цПЦР (digital PCR; dPCR): Процедура, при которой матрицы нуклеиновых кислот распределяются во множество ячеек номинально эквивалентного объема таким образом, чтобы некоторые ячейки содержали матрицу, а другие нет, с последующей ПЦР-амплификацией последовательностей-мишеней и детектированием специфических ПЦР-продуктов, при условии подсчета количества ячеек с положительным и отрицательным сигналами для матрицы-мишени.

Примечание 1 - Считается, что последовательности-мишени нуклеиновых кислот распределены по ячейкам случайным образом и независимо во времени процесса разделения.

Примечание 2 - Подсчет положительных и отрицательных ячеек, как правило, основывается на детектировании конечной точки ПЦР-продуктов с последующим циклическим температурным воздействием, однако, контроль кПЦР в реальном времени кумуляции ПЦР продукта также возможен для некоторых цПЦР-платформ.

 

3.11 требуемый ген; GOI (gene of interest; GOI): Исследуемая последовательность-мишень гена.

3.12 значение лямбда (lambda value; ): Среднее число мишеней на ячейку цПЦР, на основе доли капель, в которых произошла амплификация.

Примечание 1 - Основные величины цПЦР для расчета лямбды - это количество положительных ячеек (NP) и общее количество ячеек (NT).

 

3.13 предел количественного определения; LOQ (limit of quantification; LOQ): Наименьшая концентрация или количество последовательностей-мишеней нуклеиновой кислоты на определенный объем, которую(ый) можно измерить с приемлемым уровнем достоверности в соответствии с условиями, указанными в методе.

Примечание 1 - Как правило, выражается как (фактическое) значение сигнала или измерения, которое дает оценку с определенным коэффициентом вариации (CV).

 

[ИСО 16577:2016, 3.91, изменено - заменено "содержание изучаемого аналита" на "количество последовательностей-мишеней нуклеиновой кислоты", "количество матриц" на "объем" и "относительное среднеквадратическое отклонение (RSD)" на "коэффициент вариации (CV)"]

3.14 предел обнаружения; LOD (limit of detection; LOD): Значение измеренной величины, полученное с применением методики измерения, для которой вероятность ложного утверждения об отсутствии компонента в материале есть , при условии, что есть вероятность ложного утверждения о его присутствии.

[Руководство ИСО/МЭК 99:2007, 4.18, определение для "предела обнаружения"; примечания исключены]

3.15 линейность (linearity): Способность метода анализа в определенном диапазоне давать аналитический сигнал или результаты, пропорциональные количеству последовательностей-мишеней нуклеиновой кислоты, определяемой в лабораторной пробе.

Примечание 1 - В случае кПЦР порог цикла пропорционален логарифму по основанию 10 количества последовательностей-мишеней нуклеиновой кислоты.

Примечание 2 - Термин "линейность" часто связан с диапазоном линейности метода и означает способность метода предоставить сигнал или результат, прямо пропорциональный концентрации последовательности-мишени нуклеиновой кислоты.

 

[ИСО 16577:2016, 3.92, изменено - добавлены примечания 1 и 2; "количество аналита" заменено на "количество последовательностей-мишеней нуклеиновой кислоты"]

3.16 измеряемая величина (measurand): Величина, подлежащая измерению.

Примечание 1 - Спецификация измеряемой величины требует знаний рода величины, описания явления, тела или вещества, которым присуща эта величина, включая любые существенные составляющие, в том числе и химические.

Примечание 2 - Во втором издании VIM и в МЭК 60050-300:2001 измеряемая величина определяется как "величина, являющаяся объектом измерения".

Примечание 3 - Измерение, включая измерительную систему и условия, при которых оно выполняется, может изменить явление, тело или вещество таким образом, что измеренная величина может отличаться от измеряемой величины по определению. В этом случае необходимо вводить соответствующую поправку.

 

Пример 1 - На количество гена-мишени, измеренного с помощью ПЦР, влияет длина ампликона ПЦР-анализа и размер фрагмента матрицы (~ < длина ампликона).

Пример 2 - Денатурация ДНК в пробе в ssDNA влияет на количественное определение с помощью цПЦР, так как две нити разделены.

[Руководство ИСО/МЭК 99:2007, 2.23, изменено - изменены примечание 3 и примеры, и исключено примечание 4]

3.17 кривая плавления (melting curve): Анализ, описывающий характеристики диссоциации двухцепочечной ДНК, наблюдаемой при нагревании.

[ИСО 16577:2016, 3.107, изменено - исключено примечание 1]

3.18 температура плавления T_m (melting temperature T_m): Температура, при которой 50% спиралей двухцепочечной ДНК диссоциированные, так как спираль ДНК плавится в определенном температурном диапазоне, а не при одной четко обозначенной температуре.

[ИСО 16577:2016, 3.108]

3.19 матричная [информационная] РНК; мРНК (messenger RNA; mRNA): Подтип рибонуклеиновой кислоты, служащий матрицей для синтеза белка.

3.20 безматричный контроль; NTC (no template control; NTC): Контролируемая реакция, содержащая все реактивы, за исключением экстрагированной пробы матричной нуклеиновой кислоты.

Примечание 1 - Эта контролируемая реакция используется для демонстрации отсутствия загрязняющих нуклеиновых кислот. Вместо матричной ДНК, например, в реакцию добавляют соответствующий объем воды, не содержащей нуклеиновых кислот. Иногда используют термин "контроль ПЦР-реактива".

 

3.21 нормализация (normalization): Изменение измеренного количества последовательности-мишени нуклеиновой кислоты путем вычитания (C_q-шкала) или деления (линейная шкала) на количество или количества параметров, которые отражают неспецифические технические факторы.

3.22 ячейки (partitions): Капли или полости номинально эквивалентного объема, в которых смесь цПЦР реагентов случайным образом распределяется, а затем амплифицируется с помощью ПЦР.

3.23 ПЦР-анализ; анализ (PCR assay, assay): Метод измерения кПЦР (см. 3.25) или цПЦР (см. 3.10) с использованием заданных олигонуклеотидных праймеров (и, в некоторых случаях, зонда или зондов), который используется для идентификации и/или количественного определения целевых нуклеиновых кислот.

3.24 эффективность ПЦР E (PCR efficiency E): Фракции молекул, амплифицируемые в каждом цикле ПЦР.

Пример - Если пробирка содержит 100 молекул-мишеней, а после одного цикла ПЦР содержит 180 молекул, то E = 0,8. Вычисленный коэффициент амплификации регистрируют как процент или долю от 1. А 100%-ная эффективность равна удвоению ампликона в течение каждого цикла.

3.25 количественная ПЦР в реальном времени; кПЦР (quantitative real-time PCR; qPCR): Энзиматическая процедура, сочетающая амплификацию специфических сегментов ДНК in vitro с количественной оценкой специфических ПЦР продуктов в процессе амплификации.

Примечание 1 - В то время как ПЦР воспроизводит копии соответствующей ДНК последовательности, флуоресцентный маркер флуоресцирует прямо пропорционально количеству присутствующей ДНК (что теоретически может быть рассчитано путем обратных вычислений для получения исходного количества определенной ДНК, присутствующей в пробе перед началом ПЦР).

 

[ИСО 16577:2016, 3.162, изменено - слово "количественная" добавлено к термину, а "количественная оценка" к определению]

3.26 референсный ген; эндогенный ген (reference gene; endogenous gene): Ген-мишень, присутствующий в каждой пробе в приблизительно равной концентрации, который устойчив к ответной флуктуации в связи с изменениями в биологических условиях или условиях исследования, или стабилен в определенных видах или таксоне.

Примечание 1 - Референсные гены традиционно считались генами "домашнего хозяйства". Однако при измерении РНК, могут использоваться мишени, которые не считаются генами домашнего хозяйства; следовательно, ссылочный термин сейчас - это референсный ген [1].

 

3.27 обратная транскрипция; RT (reverse transcription; RT): Процесс получения кДНК из матрицы РНК, используя ферментативную активность ревертазы, связанной с одним или более олигонуклеотидным праймером при подходящем наборе условий.

[ИСО 16577:2016, 3.180, изменено - "ДНК" заменено на кДНК"]

3.28 эффективность обратной транскрипции; эффективность RT (reverse transcription efficiency; RT efficiency): Соотношение молекул РНК, преобразованных в кДНК, выраженное в процентах.

Пример - Эффективность RT 80% означает, что 80% матриц РНК были преобразованы в кДНК.

3.29 отрицательный контроль RT [RT minus control; RT(-)]: ПЦР с обратной транскрипцией, содержащая матричную нуклеиновую кислоту испытуемой пробы и все реагенты амплификации, за исключением энзимов ревертазы.

Примечание 1 - Отрицательный контроль RT используют при количественной оценке РНК и фоновых величин, получаемых из остаточной геномной ДНК в пробе.

 

3.30 цПЦР с обратной транскрипцией; RT-цПЦР (reverse transcription dPCR; RT-dPCR): Процесс, с помощью которого нить РНК сначала обратно транскрибируется в свой ДНК-комплемент (комплементарная ДНК или кДНК) с использованием ревертазы, и результатирующая кДНК амплифицируется с помощью цПЦР.

Примечание 1 - Этот процесс может быть одно- или двухэтапным.

Примечание 2 - При одноэтапной RT-цПЦР этапы RT и цПЦР амплификации выполняют один за другим в одной пробирке с ген-специфическими праймерами.

Примечание 3 - При двухэтапной RT-цПЦР этапы RT и цПЦР амплификации выполняют как две независимые реакции. В данном случае этап RT может использовать неспецифические праймеры (т.е. смесь олиго-dT праймеров и/или случайных олигонуклеотидов) для получения глобальной кДНК популяции из всех матриц в пробе РНК. кДНК затем используют для последующего анализа с помощью цПЦР и исследуют на интересующие последовательности с помощью ген-специфических ПЦР-праймеров.

 

3.31 количественная ПЦР с обратной транскрипцией; RT-кПЦР (reverse transcription qPCR; RT-qPCR): Процесс, с помощью которого нить РНК сначала обратно транскрибируется в свой ДНК-комплемент (комплементарная ДНК или кДНК) с использованием ревертазы, и результатирующая кДНК амплифицируется с помощью кПЦР.

Примечание 1 - Этот процесс может быть одно- или двухэтапным, так же как и в случае с RT-цПЦР.

 

[ИСО 16577:2016, 3.181 изменено - добавлено примечание]

3.32 проба (sample): Небольшая часть или количество, взятые из популяции или партии, в идеале представляющие собой репрезентативную выборку из всего материала.

[ИСО 16577:2016, 3.185]

3.33 специфичность; аналитическая специфичность (specificity; analytical specificity): Способность методики измерения самостоятельно определить величину, которую необходимо измерить с ее помощью.

Пример - Специфичность ПЦР-анализа представляет собой его способность детектировать исключительно намеченные мишени, и чтобы на количественную оценку мишени не оказывала влияние перекрестная специфичность родственных или потенциально мешающих нуклеиновых кислот или условий, относящихся к пробе.

[ИСО 15193:2009, 3.9, изменено - добавлен пример]

3.34 одиночный нуклеотидный полиморфизм; SNP (single nucleotide polymorphism; SNP): Однонуклеотидные позиции в генетической последовательности, встречающиеся с ощутимой частотой в популяции.

[ИСО 25720:2009, 4.23]

3.35 однонуклеотидная вариация; SNV (single nucleotide variant; SNV): Вариация последовательности ДНК, встречающаяся, когда одиночный нуклеотид, A, T, C или G, в геноме (или другая последовательность-мишень) отличается в матрицах.

3.36 последовательность-мишень; последовательность-мишень нуклеиновой кислоты (target sequence; nucleic acid target sequence): Специфическая последовательность ДНК, предназначенная для детектирования, например, с помощью ПЦР.

[ИСО 16577:2016, 3.203]

3.37 матрица (template): Нить ДНК или РНК, задающая нуклеотидную последовательность вновь синтезированной нити ДНК или РНК, из которых две нити являются комплементарными.

[ИСО 16577:2016, 3.206]

3.38 испытуемая проба (test sample): Проба, подготовленная для испытания или анализа, всю или часть которой используют для испытания или анализа одновременно.

[ИСО 16577:2016, 3.210]

3.39 общая нуклеиновая кислота (total nucleic acid): Общее количество нуклеиновой кислоты в пробе после экстракции нуклеиновой кислоты, выраженное как концентрация по массе.

Примечание 1 - Общая нуклеиновая кислота относится к ожидаемому большинству видов в определенном экстракте (например, ДНК или РНК).