ГОСТ Р ИСО 20395-2023. Национальный стандарт Российской Федерации. Биотехнология. Требования к оценке эффективности методов количественного определения последовательностей нуклеиновых кислот-мишеней. Количественная ПЦР и цифровая ПЦР

Пункт для проверки

Значимость

ПЛАН ЭКСПЕРИМЕНТА

Определение экспериментальной и контрольной групп

E

Количество в каждой группе

E

Анализ проведен головной лабораторией или исследовательской лабораторией?

D

Подтверждение вкладов автора

D

ПРОБА

Описание

E

Объем/масса обрабатываемой пробы

D

Микроскопическое или макроскопическое препарирование

E

Процедура обработки

E

Если заморожена - каким способом и как быстро?

E

Если химически связанная - с чем, как быстро?

E

Условия и период хранения пробы [особенно для химически связанных формалином и залитых парафином (FFPE) проб]

E

ЭКСТРАКЦИЯ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Процедура и/или оборудование

E

Наименование набора и данные по модификации

E

Источник дополнительных используемых реагентов

D

Данные по обработке ДНКазы или РНКазы

E

Оценка загрязнения (ДНК или РНК)

E

Количественное определение нуклеиновой кислоты

E

Прибор и метод

E

Чистота (A260/A280)

D

Частота выявления

D

Метод/прибор определения целостности РНК

E

RIN/RQI или C_q транскриптов 3' и 5'

E

Следы электрофореза

D

Испытание на ингибирование (разведения C_q, спайк и прочее)

E

ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ

Полные условия реакции

E

Количество РНК и реакционный объем

E

Праймирующий олигонуклеотид (при использовании GSP) и концентрация

E

Обратная транскриптаза и концентрация

E

Температура и время

E

Производитель реагентов и каталожные номера

D

C_qs с и без RT

D

Условия хранения кДНК

D

ИНФОРМАЦИЯ О МИШЕНИ кПЦР

Учетный номер последовательности

E

Расположение ампликона

D

Длина ампликона

E

Скрининг специфичности in silico (BLAST и т.д.)

E

Псевдогены, ретропсевдогены или другие гомологи?

D

Выравнивание последовательности

D

Анализ вторичной структуры ампликона

D

Расположение каждого праймера по экзону или интрону (если применимо)

E

Какие сплайс-варианты являются целевыми?

E

ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ кПЦР

Последовательности праймеров

E

Идентификационный номер RTPrimerDB

D

Последовательности зондов

D

Расположение и идентичность любых модификаций

E

Производитель олигонуклеотидов

D

Метод очистки

D

ПРОТОКОЛ кПЦР

Полные условия реакции

E

Объем реакции и количество кДНК/ДНК

E

Праймер, (зонд), концентрации Mg++ и dNTP

E

Идентификация и концентрация полимеразы

E

Наименование и производитель буфера/набора

E

Точный химический состав буфера

D

Добавки (SYBR Green I, DMSO и др.)

E

Производитель планшетов/пробирок и каталожный номер

D

Полные параметры термоциклирования

E

Настройка реакции (ручная/роботизированная)

D

Производитель прибора для кПЦР

E

ВАЛИДАЦИЯ кПЦР

Доказательства оптимизации (из градиентов)

D

Специфичность (гель, последовательность, плавление или расщепление)

E

Для SYBR Green I, C_q NTC

E

Стандартные кривые с наклоном и точкой пересечения с осью Y

E

Эффективность ПЦР, рассчитанная по наклону

E

Доверительный интервал для эффективности ПЦР или среднеквадратическая ошибка

D

R² стандартной кривой

E

Линейный динамический диапазон

E

Изменение C_q на нижнем пределе

E

Доверительные интервалы во всем диапазоне

D

Доказательства для предела обнаружения

E

При мультиплексном анализе эффективность и LOD каждого анализа

E

АНАЛИЗ ДАННЫХ

Программа анализа кПЦР (источник, версия)

E

Определение метода C_q

E

Идентификация выброса и его размещение

E

Результаты NTC

E

Обоснование количества и выбор референсных генов

E

Описание метода нормализации

E

Количество и соответствие биологических повторов

D

Количество и этап (RT или кПЦР) технических повторов

E

Повторяемость (вариации внутри анализа)

E

Воспроизводимость (изменение между анализами, % CV)

D

Анализ мощности

D

Статистические методы значимости результатов

E

Программное обеспечение (источник, версия)

E

Представление данных по C_q или необработанных данных с использованием языка разметки данных ПЦР в реальном времени (RDML)

D

Обозначения:

E - необходимые;

D - желаемые.

Пункт для проверки

Значимость

ПЛАН ЭКСПЕРИМЕНТА

Определение экспериментальной и контрольной групп

E

Количество в каждой группе

E

Анализ проведен головной лабораторией или исследовательской лабораторией?

D

Анализ мощности

D

ПРОБА

Описание

E

Объем/масса обрабатываемой пробы

E

Микроскопическое или макроскопическое препарирование

E

Процедура обработки

E

Если заморожена - каким способом и как быстро?

E

Если химически связанная - с чем, как быстро?

E

Условия и период хранения пробы [особенно для FFPE проб]

E

ЭКСТРАКЦИЯ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Количественное определение - прибор/метод

E

Условия хранения: температура, концентрация, продолжительность, буфер

E

Количественное определение ДНК или РНК

E

Прибор/метод количественной оценки/оценки целостности, например, RIN/RQI и маркировки или 3':5'

E

Информация по структуре матрицы

E

Модификация матрицы (расщепление, обработка ультразвуком, предварительная амплификация и т.д.)

E

Обработка матрицы (начальный нагрев или химическая денатурация)

E

Ингибиторное разведение и спайк

E

Оценка загрязнения ДНК образца РНК

E

Данные об обработке ДНКазы, если выполнялась

E

Производитель используемых реагентов и каталожный номер

D

Хранение нуклеиновой кислоты: температура, концентрация, продолжительность, буфер

E

ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ (при необходимости)

Метод праймирования кДНК + концентрация

E

Одно- или двухэтапный протокол

E

Количество РНК, используемое на реакцию

E

Данные по компонентам и условиям реакции

E

Эффективность RT

D

Предполагаемые копии, измеренные с добавлением и без добавления RT

D

Производитель используемых реагентов и каталожный номер

D

Объем реакции (для двухэтапной реакции обратной транскрипции)

D

Хранение кДНК: температура, концентрация, продолжительность, буфер

D

ИНФОРМАЦИЯ О МИШЕНИ цПЦР

Учетный номер последовательности

E

Расположение ампликона

D

Длина ампликона

E

Скрининг специфичности in silico (BLAST и т.д.)

E

Псевдогены, ретропсевдогены или другие гомологи?

D

Выравнивание последовательности

D

Анализ вторичной структуры ампликона и содержание GC

D

Расположение каждого праймера по экзону или интрону (если применимо)

E

Какие сплайс-варианты являются целевыми?

E

ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ цПЦР

Последовательности праймеров и/или последовательность окружения ампликона

E

Идентификационный номер RTPrimerDB

D

Последовательности зондов

D

Расположение и идентичность любых модификаций

E

Производитель олигонуклеотидов

D

Метод очистки

D

ПРОТОКОЛ цПЦР

Полные условия реакции

E

Объем реакции и количество РНК/кДНК/ДНК

E

Праймер, (зонд), концентрации Mg++ и dNTP

E

Идентификация и концентрация полимеразы

E

Каталожный номер и производитель буфера/набора

E

Точный химический состав буфера

D

Добавки (SYBR Green I, DMSO и др.)

E

Производитель планшетов/пробирок и каталожный номер

D

Полные параметры термоциклирования

E

Настройка реакции

D

Гравиметрическое или объемное разбавление (ручное/роботизированное)

D

Общий подготовленный объем реакции ПЦР

D

Номер ячейки

E

Объем отдельной ячейки

E

Общий объем измеренных ячеек (эффективный размер реакции)

E

Вариация объема ячейки/среднеквадратическое отклонение

D

Исчерпывающая информация и надлежащее использование контролей

E

Производитель прибора цПЦР

E

ВАЛИДАЦИЯ цПЦР

Данные оптимизации для анализа

D

Специфичность (при измерении редких мутаций, последовательностей патогенов и т.д.)

E

Предел обнаружения калибровочного контроля

D

При мультиплексном анализе, сравнение с одиночными анализами

E

АНАЛИЗ ДАННЫХ

Среднее количество копий на ячейку ( или эквивалент)

E

Программа анализа цПЦР (источник, версия)

E

Идентификация выброса и его размещение

E

Результаты NTC

E

Примеры положительных и отрицательных результатов экспериментов в качестве дополнительных данных

E

При необходимости, обоснование количества и выбора эталонных генов

E

При необходимости, описание метода нормализации

E

Количество и соответствие биологических повторов

D

Количество и этап (RT или кПЦР) технических повторов

E

Повторяемость (вариации внутри анализа)

E

Воспроизводимость (различия между анализами/пользователями/лабораториями и т.д.)

D

Вариация и доверительный интервал эксперимента

E

Статистические методы, используемые для анализа

E

Отправка данных с использованием RDML

D

Обозначения:

E - необходимые;

D - желаемые.