ГОСТ Р ИСО 20395-2023. Национальный стандарт Российской Федерации. Биотехнология. Требования к оценке эффективности методов количественного определения последовательностей нуклеиновых кислот-мишеней. Количественная ПЦР и цифровая ПЦР
Приложение D
(справочное)
НЕОПРЕДЕЛЕННОСТЬ ИЗМЕРЕНИЙ
D.1 Общие положения
Как обработка биологической пробы (отбор проб из исходного материала, хранение, экстракция нуклеиновых кислот), так и измерение нуклеиновых кислот влияют на неопределенность значения количества, полученного с помощью метода измерения на основе кПЦР или цПЦР. Результаты могут быть систематическими; связаны с положительной или отрицательной систематической погрешностью (например, экстракция нуклеиновых кислот или эффективность RT < 100%), или случайными (относящиеся к прецизионности применяемых методов). Составной экспериментальный план с повторением для разных этапов всего процесса обеспечивает прецизионность и прогнозирует случайные воздействия на неопределенность измерения в результате [79].
Обзор источников неопределенности, которые могут повлиять на измерения кПЦР и цПЦР, представлен в D.2 и D.3, чтобы помочь разработчикам методов кПЦР или цПЦР учесть факторы, которые могут иметь значение при разработке соответствующего бюджета неопределенности измерений.
D.2 Источники неопределенности для всего процесса (кПЦР)
Возможные источники неопределенности во всем процессе от биологической пробы до количественного определения нуклеиновых кислот изображены на рисунке D.1 для процедуры измерения, основанной на кПЦР. Для RT-кПЦР уникальные источники неопределенности включают обработку ДНКазой и RT. Для методов кПЦР, использующих калибровочную кривую (см. 4.2.2), имеют значение источники неопределенности в значении, присвоенном калибровочному материалу.
Рисунок D.1 - Причинно-следственная диаграмма. Весь процесс
вклада неопределенности для процедуры измерений,
основанной на кПЦР
Центральная стрелка представляет экспериментальный процесс от пробы до метода количественного определения. Ветви, ведущие в последовательность эксперимента, характеризуют источники изменчивости, вносящие вклад в неопределенность на различных этапах процесса. Адаптировано из [80].
D.3 Источники неопределенности для цПЦР
Источники неопределенности, влияющие на цПЦР, изображены на рисунке D.2 для процедуры измерения на основе капельной цПЦР, применяемой для количественного определения концентрации числа копий (см. 4.2.3).
Cprimers/probe - концентрация праймеров и пробы;
Dfsample - коэффициент разведения пробы перед добавлением
ПЦР-микса; DfPCR - коэффициент разведения пробы в ПЦР-миксе;
Mdil - масса разбавителя; Mdil+sample - масса разбавителя
и пробы, Mpremix - масса микса до отбора пробы;
Mmix - масса ПЦР-микса с пробой; Vd - объем капель
Примечание - Воспроизведено с разрешения [58].
Рисунок D.2 - Причинно-следственная диаграмма. Вклад
неопределенности для процедуры измерения, основанной на цПЦР
Подписаться на обновления