ГОСТ Р ИСО 20395-2023. Национальный стандарт Российской Федерации. Биотехнология. Требования к оценке эффективности методов количественного определения последовательностей нуклеиновых кислот-мишеней. Количественная ПЦР и цифровая ПЦР

Приложение C

(справочное)

 

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПЦР

 

C.1 Общие положения

ПЦР-эффективность кПЦР, как правило, проверяют путем построения калибровочной кривой или серией разведений (см. 6.2.3). В данном приложении приведена информация по порядку проведения определения и вычислению эффективности ПЦР.

C.2 Порядок проведения определения

Для оценки эффективности кПЦР калибровочные материалы или проба для приготовления серии разведений ("стандартные растворы"), формирующие стандартную кривую, должны состоять из очищенной матричной ДНК. Это могут быть синтетические олигонуклеотиды, очищенная плазмида, очищенная гДНК или очищенный продукт ПЦР. Для оценки эффективности RT-кПЦР стандартные растворы должны состоять из очищенной матричной РНК: например, РНК транскрибированная in vitro, или очищенная клеточная РНК. Стандартные растворы могут быть приготовлены из высококонцентрированного сырья, которое последовательно разбавляют.

Рекомендуется нуклеиновая кислота-носитель (без перекрестной реактивности с анализом) для поддержания общего содержания нуклеиновой кислоты в реакционной смеси эквивалентным в серии разведений, особенно для молекул с низкой молекулярной массой, таких как олигонуклеотиды или плазмидная ДНК, которые могут прилепляться к пробиркам. Стандартная кривая должна охватывать как можно более широкий диапазон концентраций и быть применимой к планируемому использованию процедуры измерения.

Точная оценка эффективности ПЦР характеризуется узким доверительным интервалом. Это достигается с помощью большого количества стандартов. Рекомендуется как минимум 24 измерения, распределенные, например, в виде четырех повторов при шести различных концентрациях [78].

C.3 Вычисления

Предлагаются следующие показатели качества и параметры испытаний:

a) Повторяющиеся данные проверяют на наличие выбросов. Выбросы могут быть идентифицированы, например, с помощью испытания проб тестом Грабба относительно остатка. Рекомендуется использовать доверительный интервал 95%.

1) Если обнаружен один выброс, данные и анализ должны быть пересмотрены для определения причины выброса. Если причина идентифицирована и может быть исключена, данный выброс может быть удален из анализа, а оставшиеся данные могут быть использованы для построения стандартной кривой;

2) Если более одного выброса обнаружено для пробы, данные, соответствующие этой пробе, не должны использоваться для построения стандартной кривой.

b) Данные кПЦР из "стандартных растворов" вычисляют по формуле с помощью линейной регрессии

 

y = a + bx, (C.1)

 

где y - значение C_q;

x - десятичный логарифм концентрации [log₁₀(c_i) или относительной концентрации (в случае серии разведений)] стандартного раствора;

a - отрезок прямой;

b - градиент.

Необходимо оценить коэффициент корреляции линейной регрессии (см. 6.2.3).

Можно выполнить дополнительное испытание на линейность, например, путем оценки с помощью проведения испытаний или сравнения линейной аппроксимации с многочленами второго и третьего порядка по формулам:

 

y = a + bx + cx², (C.2)

 

y = a + bx + cx² + dx³, (C.3)

 

где c - коэффициент члена второго порядка;

d - коэффициент члена третьего порядка.

Важность подгоночных параметров c и d сравнивают с наклоном b. Значительное взвешивание c и d предполагает отклонение от линейности при низкой и/или высокой концентрации.

Если данные показывают отклонение от линейности, крайняя точка данных должна быть удалена, а оставшиеся данные, теперь охватывающие более узкий диапазон, должны быть проверены на линейность.

Для данных кПЦР отклонение от линейности часто наблюдается при высокой концентрации, особенно на определенных приборах. Это отклонение может быть связано с неправильным вычитанием базовой линии программным обеспечением прибора из-за раннего увеличения флуоресценции наиболее концентрированной пробы. Отклонение от линейности может сильно повлиять на оценку эффективности ПЦР, поскольку пробы, имеющие отклонения, с экстремальными концентрациями и, из-за более сильного эффекта линейной регрессии, оказывают сильное влияние на подгонку, в результате чего оценки эффективности ПЦР значительно выше 100%, что теоретически невозможно. Если возможно, следует внести коррективы в подход к установлению базовой линии или процедуру измерения, валидированную в узком диапазоне концентраций (см. 6.3.3).

c) Среднюю эффективность ПЦР оценивают на основании нескольких определений со средним градиентом по формуле

 

, (C.4)

 

со среднеквадратической погрешностью SE - по формуле

 

, (C.5)

 

и доверительным интервалом (CI) - по формуле

 

, (C.6)

 

где t_95%,n-2 - коэффициент расширения при доверительном уровне 95%, вычисленный по обратному t-распределению;

n - количество экспериментов, проведенных для определения эффективности ПЦР.