ГОСТ Р ИСО 20395-2023. Национальный стандарт Российской Федерации. Биотехнология. Требования к оценке эффективности методов количественного определения последовательностей нуклеиновых кислот-мишеней. Количественная ПЦР и цифровая ПЦР

Приложение B

(справочное)

 

ЦЕЛОСТНОСТЬ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ

 

B.1 Общие положения

Исследование целостности нуклеиновой кислоты позволяет оценить факторы, которые могут повлиять на эффективность процедуры измерения, основанной на кПЦР- или цПЦР, как, например, наличие деградации нуклеиновой кислоты (короткие фрагменты) или высокомолекулярной ДНК (см. 5.3). Методы оценки распределения размеров фрагментов ДНК или РНК в пробе перечислены в B.2 и B.3, соответственно. Примеры методов анализа целостности нуклеиновых кислот, применяемых к ряду клинических проб, приведены в [20].

B.2 Методы оценки целостности ДНК

B.2.1 Электрофорез

Для клеточной гДНК полоса с высокой молекулярной массой обычно присутствует в верхней части геля. Пятна или кометные хвосты свидетельствуют о деградации и фрагментации пробы. Наоборот, для бесклеточной ДНК ожидается размер фрагмента основного пика примерно 130 - 170 пар оснований (bp) [69]. Для некоторых приборов специальные алгоритмы обеспечивают количественный показатель целостности ДНК, основанный на особенностях электрофоретического анализа.

B.2.2 ПЦР длинных фрагментов

ПЦР длинных фрагментов можно использовать для амплификации последовательностей до 15 т.п.н. (kb) с использованием определенных типов полимераз. Она дает качественную оценку целостности ДНК [70].

B.2.3 ПЦР-анализ с ампликонами разной длины

Одна и та же геномная область нацелена на несколько наборов праймеров для ПЦР с разными длинами ампликонов и обеспечивает индекс или отношение амплифицируемых молекул при разных размерах фрагментов [71] - [74].

B.3 Методы оценки целостности РНК

B.3.1 Электрофорез

Электрофоретические профили представляют отчетливые полосы для разных групп молекул [рибосомальная РНК (рРНК) разного размера, малая РНК и т.д.] и показывают смещение размера фрагмента, связанное с деградацией. Специальные алгоритмы обеспечивают количественный показатель целостности РНК, основанный на особенностях электрофоретического анализа [75].

Алгоритмы, которые основаны в основном на характеристиках электрофоретического анализа рРНК, подходят для оценки целостности молекул РНК высокого качества, где пики рРНК различимы. Для прокариотической РНК для оценки целостности используют отношение рРНК 23S и 16S субъединиц рибосомы. Для эукариотической РНК используют отношение рРНК из 28S рРНК и 18S субъединиц рибосомы. Однако, если качество РНК серьезно снижено (например, после формалиновой фиксации ткани), эти алгоритмы не подходят для оценки качества молекул мРНК.

B.3.2 RT-кПЦР для отношения 5'/3' мРНК

Этот анализ целостности основан на измерении отношения количеств мишени, расположенной на 5'-конце, и мишени, расположенной на 3'-конце одного и того же транскрипта, с использованием RT-праймирования на основе олиго-dT. Это обеспечивает относительную меру целостности мРНК. Если РНК не повреждена, ожидается одинаковая концентрация при использовании каждого анализа (отношение равно 1), тогда как более высокое число копий 3'-анализа по сравнению с 5' ожидается, если РНК деградировала [76].

Эффективность стратегии RT-праймирования на основе 3' следует валидировать с использованием типовых испытуемых проб, поскольку может оказаться, что она неинформативна для высокофрагментированной РНК.

B.3.3 RT-кПЦР-анализ повторяющихся элементов

Концентрация экспрессируемых повторяющихся последовательностей (например, AluJ) может быть измерена как индикатор амплифицируемости мРНК [76]. Должна быть включена контрольная проба высокой целостности, чтобы явно свидетельствовать о деградации пробы.

B.3.4 Анализы RT-кПЦР с ампликонами разной длины

Что касается целостности ДНК, этот подход может быть применен к целостности РНК путем измерения одного и того же транскрипта с ампликонами разной длины [77].