ГОСТ Р ИСО 20395-2023. Национальный стандарт Российской Федерации. Биотехнология. Требования к оценке эффективности методов количественного определения последовательностей нуклеиновых кислот-мишеней. Количественная ПЦР и цифровая ПЦР

Приложение A

(справочное)

 

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ

 

A.1 Общие положения

Спектрофотометрия является широко используемым методом количественного определения общего количества нуклеиновых кислот (см. 5.2.2) и оценки чистоты нуклеиновых кислот (см. 5.4). В данном приложении представлена информация о коэффициентах поглощения для измерений общей концентрации нуклеиновых кислот, критерии интерпретации химической чистоты и примеры результатов типового спектрофотометрического УФ-анализа.

A.2 Взаимосвязь между поглощением и общей концентрацией нуклеиновых кислот

Концентрацию нуклеиновой кислоты определяют с помощью закона Бэра-Ламберта, который прогнозирует линейную корреляцию между поглощением при длине волны 260 нм и концентрацией нуклеиновой кислоты с коэффициентом оптической плотности, зависящим от определяемых количественно видов нуклеиновой кислоты (дцДНК, оцДНК, оцРНК, дцРНК).

Показатель поглощения при 260 нм, равный 1,0, эквивалентен ~ 40 мкг/мл чистой оцРНК, ~ 46 мкг/мл чистой дцРНК и ~ 50 мкг/мл чистой дцДНК. Более точный количественный анализ нуклеиновых кислот может быть выполнен в денатурирующих условиях с одноцепочечной ДНК (оцДНК) с коэффициентом поглощения 37 мкг/мл.

A.3 Коэффициенты поглощения и чистота нуклеиновых кислот

Для высококачественной пробы ДНК показания коэффициента поглощения при 260 и 280 нм (соотношение 260/280) для чистой ДНК должны быть приближены к 1,8. Если отношение заметно ниже, это может указывать на присутствие белка, фенола или других загрязняющих веществ. Если отношение приближено к 2, это может указывать на загрязнение РНК.

Для высококачественной пробы РНК отношение 260/280 должно быть приближено к 2. Наблюдались случаи, когда показания коэффициента поглощения при 260 и 280 нм, равные 1,8, свидетельствуют о наличии приблизительно 70% - 80% белка в пробах. Поскольку существует множество белков, которые ингибируют и ПЦР, и обратную транскрипцию, лаборатория должна определить свои пороговые значения для отбраковки или принятия пробы.

Следует отметить, что отношение 260/280 может варьироваться в зависимости от pH и ионной силы [68].

Отношение коэффициента поглощения при 260 нм к коэффициенту поглощения при 230 нм (отношение 260/230) в идеале должно находиться в диапазоне от 2,0 до 2,2. Если отношение заметно ниже ожидаемого, это может указывать на присутствие загрязняющих веществ, поглощающих при 230 нм.

Показания исходного поглощения следует вычесть из всех измерений (даже в случае отношения).

Дополнительное руководство приведено в ИСО 21571.

На рисунках A.1 и A.2 приведены примеры проб ДНК разного качества. Проба ДНК хорошего качества на рисунке A.1 демонстрирует отношение 260/280 от 1,8 до 2,0 и отношение 260/230 2,20. Проба ДНК низкого качества на рисунке A.2 не имеет определенного пика при 260 нм наравне с поглощением при 280 нм и большим пиком при 230 нм, что приводит к очень низкому отношению 260/230 (0,33), и отношение 260/230 < 1,8.

 

 

X - длина волны, нм; Y - поглощение

 

Рисунок A.1 - Пример считывания спектрофотометрических

показаний для пробы ДНК высокого качества

 

Поглощение в диапазоне от 220 до 350 нм показано вместе с выходными данными для концентрации ДНК (нг/мкл) и отношениями поглощения.

 

 

X - длина волны, нм; Y - поглощение

 

Рисунок A.2 - Пример считывания спектрофотометрических

показаний для пробы ДНК низкого качества

 

Поглощение в диапазоне от 220 до 350 нм показано вместе с выходными данными для концентрации ДНК (нг/мкл) и отношениями поглощения.