ГОСТ Р ИСО 20395-2023. Национальный стандарт Российской Федерации. Биотехнология. Требования к оценке эффективности методов количественного определения последовательностей нуклеиновых кислот-мишеней. Количественная ПЦР и цифровая ПЦР

10 Неопределенность измерений (MU) в измерениях кПЦР и цПЦР

 

10.1 Общие требования к расчету неопределенности измерений (MU)

Неопределенность измерений можно определить как оцениваемый диапазон значений, в пределах которого находится истинное значение измерения. Диапазон значений указывает на надежность результата измерения. Оценка неопределенности включает влияние как случайных, так и систематических погрешностей в процедуре измерения. При оценке факторов, влияющих на неопределенность результата измерения, следует учитывать все возможные источники изменчивости в процессе измерения. В приложении D приведен обзор источников неопределенности в измерениях кПЦР и цПЦР. Должны быть оценены экспериментальные данные и другие источники информации, такие как опубликованные результаты и сертификаты калибровки, для создания бюджета неопределенности, отражающего ключевые этапы анализа, влияющие на результат измерения. Дополнительные указания для вычисления неопределенности измерения приведены в [57] для кПЦР и [58] для цПЦР.

Вычисления неопределенности измерений для методов количественного анализа нуклеиновых кислот должны включать следующие оценки:

- повторяемость, прецизионность и воспроизводимость измерений кПЦР или цПЦР;

- систематическую погрешность измерений кПЦР или цПЦР;

- неопределенность значений, присвоенных эталонным материалам;

- неопределенность разведения испытуемых проб или калибровочных материалов (случайные ошибки в разведении могут быть зафиксированы во внутрилабораторной прецизионности, если повторы выполняются на протяжении всего процесса);

- неопределенность, связанную с нормализацией: неопределенность измерения эталонного(ых) гена(ов) или других генов, применяемых для нормализации (см. 4.3), должны быть надлежащим образом объединены в соответствии с формулой, используемой для вычисления нормализованного количества исследуемой мишени (например, среднее геометрическое множества количеств эталонных генов);

- другие факторы, которые могут повлиять на результат измерения.

Неопределенности должны быть объединены в соответствии с Руководством ИСО/МЭК 98-3. Коэффициент охвата, применяемый для вычисления расширенной неопределенности с заданным доверительным уровнем (например, 95%), должен учитывать количество выполненных повторов, которое определяет степени свободы, используемые для вычисления коэффициента охвата.

Анализы, проводимые при валидации метода, могут предоставить информацию по прецизионности (см. 8.2) и правильности (см. 8.6), которые можно использовать при вычислении неопределенности измерений.

На основе повторяемости и межсерийных оценок (см. 8.2) относительную стандартную неопределенность внутрилабораторной прецизионности метода (u_{precision,rel}), связанную со средней измеренной концентрацией числа копий пробы, вычисляют по формуле (см. [58])

 

, (11)

 

где n_run - количество экспериментов, выполненных в процессе валидации.

Если концентрацию стандартных проб определяют путем калибровки по эталонному материалу (см. 4.2.2), неопределенность сертифицированной концентрации эталонного материала должна быть включена в суммарную неопределенность.

Если для оценки правильности (см. 8.6) имеется независимый эталонный материал, неопределенность систематической погрешности (u_bias,rel) вычисляют по формуле

Примечание - Этот подход действителен только в тех случаях, когда не наблюдается существенной систематической погрешности, или систематическая погрешность скорректирована на указанное количество нуклеиновых кислот.

 

, (12)

 

где u_cert,rel - относительная неопределенность, связанная с сертифицированной концентрацией количества копий.

10.2 Неопределенность измерений кПЦР

Неопределенность измерений кПЦР также должна учитывать неопределенность эффективности ПЦР. Эффективность ПЦР является неотделимой от вычисления количества нуклеиновой кислоты-мишени с использованием подхода, основанного на калибровочной кривой (см. 4.2.2), поэтому вариация эффективности ПЦР может быть отражена в данных межлабораторной прецизионности при валидации метода. Для подхода относительного количественного определения (см. 4.2.4) могут использоваться доверительные интервалы эффективности ПЦР, полученные в результате оптимизации анализа (см. 6.2.3), которые должны отражать оценки эффективности ПЦР из нескольких исследований (>= 3).

10.3 Измерения, основанные на отношении

Для величин, основанных на отношении (см. 4.2.4 и 4.2.5), погрешности измерения должны учитывать корреляцию между переменными в соответствии с Руководством ИСО/МЭК 98-3:2008, 5.2. Если отношение между двумя величинами [такими как количество копий или C_q GOI и C_q эталонного(ых) гена(ов)] вычисляют с использованием усредненных значений для каждой величины, требуется поправка на корреляцию. Однако, если отношение вычисляют непосредственно для каждого повторного измерения (например, % SNV/общее количество копий SNV-содержащей области в одной реакции), поправка на корреляцию не требуется.

Дополнительное руководство по вычислению вклада прецизионности типа A в неопределенность измерений для измерений цПЦР на основе отношений (см. 4.2.5) приведено в [7].

10.4 Неопределенность измерений цПЦР

Неопределенность измерения цПЦР должна учитывать экспериментальные источники вариации; недостаточно вычислить неопределенность измерения исключительно на основе теоретических 95%-ных доверительных интервалов подсчета Пуассона [59]. Поскольку оценка Пуассона для количества нуклеиновых кислот является неотъемлемой частью количественного определения цПЦР (см. 4.2.3), экспериментальная репликация [например, выполненная в валидационных исследованиях (см. 8.2)] фиксирует этот источник неопределенности, и отдельного учета теоретической прецизионности обычно не требуется для вклада суммарной прецизионности в неопределенность измерения [см. формулу (11)] [60].

Примечание - Экспериментальные среднеквадратические отклонения могут значительно различаться. Можно вычислить ожидаемое среднеквадратическое отклонение на основе статистики Пуассона, чтобы подтвердить, что экспериментальное среднеквадратическое отклонение не дает нереально малого значения неопределенности.

 

Следует также учитывать следующие факторы, определенным образом влияющие на процедуры измерения на основе цПЦР:

a) неопределенность объема ячейки. Этот элемент необходим для количественного определения концентрации копий ДНК с помощью цПЦР (см. 4.2.3). Для измерений цПЦР на основе отношения (см. 4.2.5) неопределенность объема ячейки не требуется, однако, в особых случаях высоких значений лямбда неоднородность объема ячейки в реакции может внести вклад в неопределенность результата измерения на основе отношения [59], [61]. Опубликованные исследования можно использовать для оценки неопределенности объема ячейки [62] - [65]. Применяемое значение объема ячейки должно соответствовать типу используемых для цПЦР реагентов (мастермикс) [64];

b) классификация положительных и отрицательных ячеек. Вариация настроек пороговых значений флуоресценции влияет на количественную оценку с помощью цПЦР как концентрации числа копий, так и отношений [58], [66]. Следовательно, вклад этого источника неопределенности следует оценивать на основе данных, в которых пороговое значение было изменено для одного набора данных; например, анализ разными операторами или сравнение используемого альтернативного программного обеспечения.