ГОСТ Р ИСО 20395-2023. Национальный стандарт Российской Федерации. Биотехнология. Требования к оценке эффективности методов количественного определения последовательностей нуклеиновых кислот-мишеней. Количественная ПЦР и цифровая ПЦР

8 Валидация метода количественного определения нуклеиновых кислот

 

8.1 Общие положения

Метод количественного определения нуклеиновых кислот (кПЦР и цПЦР) должен быть валидирован. В ИСО 5725-1 приведено общее руководство по валидации метода. Должны быть предоставлены параметры эффективности метода с целью подтверждения того, что данный метод дает результаты, подходящие для предполагаемой цели с приемлемым уровнем неопределенности измерения.

Параметры эффективности метода могут включать технические требования:

- для специфичности (требования изложены в 6.2.5);

- прецизионности;

- предела количественного обнаружения LOQ;

- предела обнаружения LOD;

- правильности;

- линейности;

- устойчивости.

Требования к описанию данных характеристик для процедур измерения как кПЦР, так и цПЦР, приведены в 8.2 - 8.7, а конкретные аспекты для кПЦР и цПЦР приведены в 8.8 и 8.9, соответственно.

8.2 Прецизионность

Прецизионность - это мера изменчивости результатов независимых измерений, полученных для одной и той же пробы в оговоренных условиях. В зависимости от оговоренных условий прецизионность измерений можно разделить на повторяемость метода, внутрилабораторную прецизионность и воспроизводимость. В рамках одной лабораторной валидации должны быть определены и воспроизводимость метода, и внутрилабораторная прецизионность.

Количество повторных измерений (в рамках анализа) и независимых анализов должно быть достаточным для получения надежной оценки среднеквадратического отклонения SD. В ИСО 5725-1 приведено руководство по количеству повторных измерений, требуемых для соответствия заданной неопределенности в оценке среднеквадратического отклонения.

Однофакторный дисперсионный анализ ANOVA может быть выполнен для вычисления среднеквадратического отклонения относительной повторяемости S_repeat,rel и относительной поэтапной вариации S_run,rel по формулам:

 

, (8)

 

(9)

 

где MS_{within run} - среднее арифметическое квадратов серии, вычисленное с помощью однофакторного анализа ANOVA;

MS_{between run} - внутрисерийное среднее арифметическое квадратов, вычисленное с помощью однофакторного анализа ANOVA;

- среднее значение повторений на серию;

- средняя концентрация измеренного количество копий пробы по всем сериям.

8.3 LOQ

Необходимо указать прецизионность, связанную с LOQ; например, как среднеквадратическое отклонение SD или относительное SD. LOQ вычисляют на основе анализа повторов концентраций пробы в нижней части линейного диапазона процедуры измерения.

Прецизионность оценок LOQ зависит от количества повторов, выполненных для каждой концентрации и приращения концентрации между пробами. Необходимо выполнить не менее 10 повторений для каждой концентрации с небольшим приращением концентрации (в два раза выше и ниже ожидаемой концентрации для LOQ) [45] - [47].

8.4 LOD

Оценка LOD должна учитывать как статистическое распределение ложноположительных результатов, так и истинно-положительных проб [48]. Должна быть указана вероятность ложноположительного детектирования и ложноотрицательного детектирования (например, p = 0,05) или достоверность классификации истинно-положительного (равно ) или ложноотрицательного (равно ).

Частота ложноположительных результатов процедуры измерения должна быть охарактеризована как часть оценки специфичности (см. 6.2.5) и анализа отрицательного контроля (см. 4.4, 6.3.2 и 6.4). В приложениях, где LOD в основном определяют частотой ложноположительных результатов анализа, статистическое распределение истинно-положительных результатов может быть смоделировано теоретически. Например, частота ложноположительных результатов с использованием ДНК дикого типа в качестве матрицы является критической для определения LOD анализа цПЦР, измеряющего SNV, поэтому распределение истинно-положительных результатов моделируется теоретически [49].

Частоту детектирования истинно-положительных результатов следует оценивать на основе повторных измерений проб, содержащих целевые количества в нижней части рабочего диапазона процедуры измерения, где > 0% и < 100% реакций являются положительными и охватывают диапазон для требуемого уровня достоверности. Например, при 95%-ной достоверности, LOD является самой низкой концентрацией, при которой 95% повторов являются положительными. Калибровочные материалы или положительные пробы, для которых были установлены значение количества и неопределенность измерения, должны использоваться для характеристики частоты детектирования истинно-положительных результатов. Если выполняются разведения (объемные или гравиметрические), прецизионность разведений должна быть охарактеризована и использована для расчета неопределенности измерения концентрации, установленной как LOD.

Доля положительных повторов изображается на графике относительно концентрации калибровочных материалов, и она может быть интерполирована для получения большей прецизионности путем подгонки данных к сигмоидальной кривой, и получения доверительного интервала оценки LOD [47]. Прецизионность оценки LOD зависит от количества повторных проб для каждой концентрации и приращения концентрации между пробами. Необходимо выполнить не менее 10 повторов на уровень концентрации. Приращение концентрации должно быть не более чем двукратным.

Примечание - Если лаборатория не знает, где ожидать LOD, хорошая стратегия состоит в том, чтобы сначала оценить его, выполнив предварительное исследование всего с несколькими повторами при каждой концентрации и охватив более широкий диапазон концентраций, а затем выполнить большое количество повторов в узком диапазоне концентрации.

 

8.5 Линейность

Линейный диапазон процедуры измерения должен быть задокументирован.

Степень линейности в пределах этого диапазона должна быть охарактеризована относительно наклона и коэффициента корреляции (например, коэффициента корреляции Пирсона, R) с помощью регрессионного анализа ожидаемого количества нуклеиновой кислоты относительно замеренного количества нуклеиновой кислоты. Измеряемой величиной должна быть величина, измеренная с помощью метода (см. 4.2), а не промежуточная величина (например, C_q), подлежащая дальнейшей обработке данных (см. 7.4).

Пробы, используемые для оценки линейности, должны быть репрезентативными для типичных испытуемых проб и могут представлять собой калибровочные материалы или серию разведений испытуемой пробы. Для серии разведений анализируют относительное количество.

Ожидаемый наклон графика замеренного значения относительно ожидаемого значения составляет 1,0, с точкой пересечения (0,0). Рекомендуется наклон от 0,95 до 1,05. Коэффициент корреляции R² должен быть больше 0,99.

Примечание - Дополнительная информация об определении линейности в цПЦР приведена в [50]. Дополнительная информация об использовании коэффициента корреляции для верификации линейности приведена в [51].

 

8.6 Правильность

Правильность измерения - это выражение того, насколько среднее значение бесконечного числа (т.е. большого числа в действительности) результатов, полученных с помощью метода, приближается к эталонному значению. Существует три основных подхода к получению подходящего эталонного значения:

a) использование сертифицированных эталонных материалов;

b) метод "введено-найдено" с использованием проб с добавками;

c) сравнение с результатами, полученными другим методом [52].

Для перечисления a) сертифицированный стандартный образец должен иметь матрицу, очень похожую на матрицу испытуемой пробы, и целевую концентрацию числа копий в том же диапазоне, что и стандартные пробы.

8.7 Устойчивость критерия

Во время испытания на устойчивость критерия необходимо исследовать влияние небольших отклонений в соответствующих параметрах метода на эффективность метода и результаты измерений. Соответствующими параметрами метода, которые могут повлиять на результат метода, являются концентрация и источник (производитель) праймеров и зондов, состав реагентов для ПЦР, термоциклер [53] и параметры циклической термообработки.

Как правило, считается, что метод цПЦР, являющийся методом ПЦР с анализом результатов по конечной точке, более устойчивый, чем методы кПЦР, однако амплитуда флуоресценции и температура отжига являются важными параметрами для дифференциации положительных и отрицательных ячеек, поэтому концентрация и источник (производитель) праймеров и датчики и температура отжига должны варьироваться во время испытания на устойчивость.

8.8 Особые принципы валидации метода кПЦР

8.8.1 Повторяемость кПЦР или RT-кПЦР

Повторяемость процедуры измерения, основанной на кПЦР или RT-кПЦР, должна быть выражена в соответствии с используемым методом количественного определения: для подхода, использующего калибровочную кривую (см. 4.2.2), среднеквадратическое отклонение SD единиц концентрации калибровочной кривой являются подходящими, в то время как для метода относительного количественного определения (см. 4.2.4) среднеквадратическое отклонение SD должно отражать конечное количество, вычисленное с помощью методики измерения.

Для выражения повторяемости как коэффициента вариации значений C_q используют формулу (см. [47])

 

, (10)

 

где - среднеквадратическое отклонение значений C_q.

Неправильно выражать делением на среднее значение C_q. Значение повторяемости C_q, полученное по формуле (10), следует использовать для расчета повторяемости конечного количества нуклеиновой кислоты, измеренного с помощью методики измерения.

Показатели прецизионности зачастую симметричны относительно вычисленной концентрации, если они выражены на логарифмической шкале C_q. При преобразовании в линейную шкалу показатель прецизионности становится асимметричным относительно вычисленной концентрации. Поэтому следует учитывать, достаточно ли симметричной аппроксимации значений прецизионности на линейной шкале для охвата положительных и отрицательных интервалов, выраженных на логарифмической шкале.

8.8.2 Внутрилабораторная прецизионность и воспроизводимость кПЦР или RT-кПЦР

Для метода относительного количественного определения (см. 4.2.4) прецизионность между независимыми анализами или между лабораториями не должна выражаться как среднеквадратическое отклонение SD необработанных значений C_q, поскольку значения C_q несопоставимы между экспериментами из-за различий в установках пороговых значений. Прецизионность должна быть выражена для конечного количества процедуры измерения после обработки данных (см. 7.4) и нормализации данных (см. 4.3).

8.9 Особые принципы валидации метода цПЦР

Известно, что точность цПЦР зависит от значений из-за их зависимости от статистики Пуассона для учета ячеек с многочисленной занятостью [37]. В связи с этим, прецизионность цПЦР должна быть установлена как диапазон значений , а также как количество, измеренное с помощью процедуры измерения (см. 4.2) нуклеиновой кислоты-мишени. Кроме того, для мультиплексных анализов следует указать диапазон значений для матриц нуклеиновых кислот, на которые нацелены другие анализы в рамках мультиплексного анализа, поскольку это может повлиять на эффективность метода.