ГОСТ Р ИСО 20395-2023. Национальный стандарт Российской Федерации. Биотехнология. Требования к оценке эффективности методов количественного определения последовательностей нуклеиновых кислот-мишеней. Количественная ПЦР и цифровая ПЦР

7 Контроль качества данных (QC) и анализ данных

 

7.1 Общие положения

Анализ данных включает изучение исходных данных, оценку их качества и надежности, установку порога флуоресценции и предварительную обработку экспортированных исходных данных.

7.2 Критерии соответствия

7.2.1 кПЦР

Графики амплификации кПЦР обычно показывают сигмоидальную кривую отклика, соответствующую трем фазам амплификации:

a) амплификация матрицы, которая ниже предела обнаружения флуоресцентного сигнала;

b) экспоненциальная амплификация, подтверждаемая линейным наклоном в зависимости от числа циклов;

c) плато, где компоненты реакции становятся предельными; возможно, что последний будет отсутствовать в испытуемых пробах, где фаза b) проявляется на последнем числе цикла.

Процедуры измерения должны включать оценку кривых амплификации испытуемых проб для подтверждения вышеупомянутых фаз амплификации и сравнение флуоресцентных сигналов базовой линии и фазы плато с сигналами проб положительного и отрицательного контроля (см. 4.4).

7.2.2 цПЦР

Для цПЦР на основе чипа анализ изображения должен отображать равномерную дисперсию пассивного эталонного красителя по ячейкам и отсутствие пузырьков воздуха внутри чипа. Кроме того, случайное распределение положительных и отрицательных результатов должно быть подтверждено визуально.

Для цПЦР в реальном времени графики амплификации в реальном времени должны показывать воспроизводимую логарифмически-линейную амплификацию в пределах узкого окна C_q, которое относится к значению лямбда для реакции (например, ожидается, что значения C_q для реакций с одной и двумя молекулами/ячейками будут разделены одной единицей C_q [39], [40]).

Для капельной цПЦР минимальное количество принимаемых капель должно соответствовать рекомендациям производителя или заданным пользователем значениям. Критерии качества, связанные с амплитудой флуоресценции капель, должны включать:

- на графике зависимости амплитуды флуоресценции капель от числа капель не должны присутствовать полосы капель с амплитудой флуоресценции ниже отрицательного кластера капель или выше положительного кластера капель, поскольку они могут указывать на аномалии в размере капель;

- на графике зависимости амплитуды флуоресценции капель от количества капель для повторных анализов цПЦР сдвиг амплитуды флуоресценции положительных и отрицательных кластеров капель между повторами должен быть минимальным;

- доля капель с промежуточной флуоресценцией (между отрицательными и положительными кластерами капель) должна быть минимизирована во время оптимизации анализа (см. 6.2). Долю капель с промежуточной флуоресценцией необходимо контролировать и учитывать в погрешности измерения (см. 10.4).

7.3 Установка пороговых значений

7.3.1 кПЦР

Пороговые значения должны устанавливаться:

- значительно выше базовой линии фоновой флуоресценции, чтобы быть уверенным в том, что любая кривая амплификации не пересечет порог преждевременно из-за фоновой флуоресценции;

- как можно ниже, чтобы гарантировать, что порог пересекает логарифмически-линейную фазу кривой амплификации, где на него не влияет фаза плато;

- на фиксированном уровне для всех проб, измеренных одним и тем же методом на одном и том же планшете.

7.3.2 цПЦР

Положительные и отрицательные контрольные материалы (см. 4.4) последовательности высокой чистоты имеют решающее значение для установки порогового значения цПЦР и должны быть интегрированы в рабочий процесс для установки порогового значения и категоризации ячеек с промежуточной флуоресценцией (так называемый "дождь"), для которых существует несколько подходов [41] - [43].

В частности, для альтернативного дуплексного анализа (например, количественного определения SNP, когда используется одна пара праймеров и >= 2 зондов, что приводит к снижению флуоресценции в двойных положительных каплях), пороговые значения должны быть установлены (или проверены, если выполняется автоматическая установка пороговых значений) путем просмотра графиков амплификации в 2D-режиме [44].

7.4 Первичная обработка данных

7.4.1 кПЦР с использованием калибровочной кривой

Приемлемые пределы наклона калибровочной кривой должны быть указаны на основании доверительного интервала, определенного для эффективности ПЦР во время оптимизации анализа (см. 6.2.3).

7.4.2 Относительное количественное определение (кПЦР)

Рабочий процесс для первичной обработки исходных данных C_q должен включать компенсационную правку вариаций в установке пороговых значений между запусками [межпланшетная калибровка (см. 4.2.4)].

Эффективность анализа должна быть скорректирована при вычислении относительных величин [5] (см. 4.2.4).

Полный рабочий процесс шагов первичной обработки для метода относительного количественного определения зависит от применения. Например, в исследованиях экспрессии отдельных клеток транскрипты-мишени зачастую экспрессируются гетерогенно и отсутствуют в части проб отдельных клеток, что требует использования подходов для обработки отсутствующих данных [6].

7.5 Идентификация выбросов

Данные необходимо проверять на наличие выпадающих значений, например, с помощью критериев Диксона или теста Грабба. При наличии нескольких выбросов следует проводить проверки, предназначенные для обнаружения множественных выбросов.

Примечание - В ИСО 16269-4 приведено руководство по обнаружению и обработке выбросов.