ГОСТ Р ИСО 23162-2023. Национальный стандарт Российской Федерации. Исследование качества спермы базовое. Требования и методы исследований

6 Порядок проведения исследований

 

6.1 Оборудование

Подвижность сперматозоидов в значительной степени зависит от температуры окружающей среды, особенно в отношении скорости их движения.

Использование оборудования с регулируемой температурой снижает влияние факторов изменения комнатной температуры.

Для проведения исследования применяют следующее оборудование:

- лабораторные весы с диапазоном от 0,00 до 50,00 г (показания с точностью до двух десятичных знаков);

- инкубатор или теплая тарелка, в которых можно поддерживать температуру эякулята, соответствующую температуре человеческого тела, предпочтительно с подвижным лотком (орбитальный смеситель);

- вертикальный оптический микроскоп с фазово-контрастной (рекомендуются объективы с кратностью увеличения 10^x, 20^x и 40^x) и светлопольной (с кратностью увеличения 100^x, масляной иммерсией, объективом высокого разрешения) оптикой, а также увеличением окуляра 10^x и окулярным микрометром (или окулярной сеткой, или калиброванной сеткой с микрометрической шкалой столика), а также средства поддержания температуры влажных препаратов, соответствующей температуре тела (например, столик с подогревом);

- поршневой дозатор для исследования концентрации сперматозоидов вместимостью от 0 до 50 мкл или от 0 до 100 мкл;

- дозатор с вытеснением воздуха (объемом от 1 до 20 мкл, от 20 до 200 мкл и от 200 до 1000 мкл) для разбавителя, влажных препаратов и других препаратов;

- оборудование для окрашивания и подготовки к исследованию морфологических и витальных препаратов (держатели стекол, банки для окрашивания, одноразовые пипетки для заливки сред);

- центрифуга (например, для конических центрифужных пробирок вместимостью 15 мл) - поворотный ротор с качающимися стаканами предпочтительнее для получения более дискретных гранул - и либо герметичные поворотные роторы, либо герметичный ротор для защиты операторов от возможного загрязнения аэрозолем в случае повреждения пробирки во время центрифугирования;

- гемоцитометры с усовершенствованной линейкой Нэйбауэра (глубина 100 мкм).

Примечание 1 - Большинство международных экспертов рекомендуют использовать гемоцитометр с улучшенной шкалой Нэйбауэра [12], [14], [16]. Можно использовать другие гемоцитометры при условии применения расчетных коэффициентов.

Примечание 2 - Многоразовые гемоцитометры необходимо регулярно проверять, чтобы износ не приводил к изменению глубины камеры. Одноразовые гемоцитометры можно использовать при условии, что они должным образом валидированы [5].

Примечание 3 - Камеры Маклера имеют более низкую точность, чем гемоцитометры [17].

Примечание 4 - Некоторые одноразовые счетные камеры, предназначенные для анализа мочи, имеют для этой цели недостаточную точность [17].

Примечание 5 - Камеры фиксированной глубины, использующие капиллярное действие, подвержены эффекту Сегре-Зильберберга и, следовательно, будут иметь систематическую погрешность [4];

 

- влажная камера для оседания сперматозоидов в гемоцитометрах;

- вихревой смеситель (для перемешивания фиксированных суспензий сперматозоидов для оценки концентрации сперматозоидов).

6.2 Реагенты собственного производства

Разбавитель для оценки концентрации сперматозоидов может быть приготовлен самостоятельно (см. приложение D). Цель состоит в том, чтобы обездвижить (убить) сперматозоиды, чтобы сделать подсчет более надежным. Также является преимуществом предотвращение роста микроорганизмов.

6.3 Проведение исследования

6.3.1 Начало исследования

Для достоверной оценки характеристик эякулята необходимо провести его разжижение. Для большинства эякулятов это достигается в течение 30 мин, если их хранят после сбора при температуре 37 °C. Если разжижение не завершено, образец можно оставить в инкубаторе на дополнительный период времени (максимум 30 мин, чтобы можно было оценить подвижность в течение 60 мин после сбора), после чего следует начать исследование. Неполное разжижение в начале исследования, а также время между сбором эякулята и началом исследования влажного препарата должно быть зафиксировано в протоколе.

6.3.2 Макроскопическое исследование эякулята

При отсутствии метрологических эталонов физических характеристик человеческой спермы невозможно добиться надлежащей стандартизации методов или установить неопределенность измерения. Однако некоторые наблюдения, касающиеся цвета или восприятия его запаха, могут иметь клиническое значение в отношении образца или медицинского статуса пациента. Следовательно, любые комментарии, включенные в протокол, являются описанием наблюдаемых характеристик, выходящих за рамки ожидаемых.

a) Внешний вид эякулята:

1) цвет (норма: молочный, серовато-белый, желтоватый, слегка опалесцирующий; отклонения от нормы: коричневатый или красный, прозрачный, ярко-желтый);

2) разжижение (должно завершиться в течение 30 мин после эякуляции при температуре 37 °C; отклонение от нормы: наличие оставшихся комков геля).

b) Другие физические наблюдения:

1) вязкость - измеряют путем медленного стекания спермы под действием силы тяжести из пипетки с широким отверстием (например, серологические пипетки вместимостью 5 мл или нетоксичные стеклянные или пластиковые пипетки Пастера). Норма: дискретные капли с "нитями" < 2 см;

2) запах (у спермы отсутствует "нормальный" запах, и ее запах весьма субъективен. Однако сильный гнилостный запах часто указывает на активную инфекцию; слабый гнилостный запах может свидетельствовать о длительном воздержании; сильный запах мочи может указывать на загрязнение спермы мочой);

3) pH спермы - измеряют в течение 30 мин после сбора эякулята; в случае отсутствия сперматозоидов и небольшого объема спермы допустимо нанесение аликвоты разжиженной спермы на тест-полоску pH.

6.3.3 Прямая микроскопия влажного препарата

Влажный препарат готовят, помещая 10 мкл аликвоты тщательно перемешанной спермы на маркированное, предварительно подогретое, предметное стекло и накрывая его предварительно нагретым покровным стеклом размером 22 x 22 мм (толщина N 1 1/2 или N 2, чтобы обеспечить полное распределение капли) для получения глубины препарата около 20 мкм (для покровных стекол размером 18 x 18 мм требуется только 6,5 мкл аликвоты для получения такой же глубины).

Наблюдают за наличием сперматозоидов, других клеток, кристаллов.

Обращают внимание на наличие агглютинатов и агрегатов сперматозоидов.

Оценивают подходящее разведение для исследования концентрации сперматозоидов (см. приложение E).

Клеточные и неклеточные элементы, которые могут присутствовать в эякуляте пациента, не имеют стандартных образцов и, следовательно, не могут быть объективно оценены, в том числе и с использованием описаний качественных характеристик. Однако некоторые наблюдения могут иметь клиническое значение в отношении медицинского статуса пациента. Таким образом, любые комментарии, включенные в протокол, следует рассматривать как сделанные в порядке исключения, т.е. как попытки описать наблюдения, выходящие за рамки ожидаемых. Лаборатория должна гарантировать, что она может продемонстрировать минимальную разницу между результатами исследования, полученными разными специалистами.

6.3.4 Исследование подвижности сперматозоидов

Должны быть приготовлены два независимых влажных препарата из тщательно перемешанного образца, хранившегося при температуре от 35 °C до 37 °C.

В каждой повторности необходимо оценивать не менее четырех различных полей видимости.

В каждой повторности должно быть классифицировано не менее 200 сперматозоидов.

Каждый исследованный сперматозоид необходимо отнести к соответствующему классу в зависимости от его подвижности: как быстро движущийся по прямолинейной траектории (быстрая поступательная подвижность сперматозоида); медленно движущийся по прямолинейной траектории (медленная поступательная подвижность сперматозоида); подвижный, однако не обладающий поступательной подвижностью по прямой; неподвижный (см. таблицу 1).

 

Таблица 1

 

Определение классов подвижности сперматозоидов

 

Класс	Тип подвижности
Быстрая поступательная подвижность (a)	Активные движения хвоста сперматозоида, скорость движения не менее 25 мкм/с
Медленная поступательная подвижность (b)	Активные движения хвоста сперматозоида, скорость движения не менее 5 мкм/с, но не более 25 мкм/с
Непоступательная подвижность (c)	Активные движения хвоста сперматозоида, скорость движения от 0 до 4 мкм/с
Отсутствие подвижности (d)	Отсутствие активных движений хвостом

 

Примечание 1 - В каждом поле видимости сначала подсчитывают сперматозоиды, обладающие быстрой и медленной поступательной подвижностью, затем сперматозоиды с непоступательной подвижностью и неподвижные сперматозоиды в пределах одного поля видимости. Если концентрация сперматозоидов высока, рекомендуется подсчитывать только те сперматозоиды, которые видны в меньшем поле зрения, например: в четырех центральных квадратах сетки счетной камеры или сетки окуляра.

Примечание 2 - Подвижные и неподвижные сперматозоиды, связанные в агглютинаты или агрегаты, не учитывают для определения класса подвижности. Если предполагается, что более 20% - 25% сперматозоидов застревают в таких скоплениях и, следовательно, не учитываются для определения класса подвижности, то такая информация должна быть зафиксирована в протоколе.

 

Для вычисления результата с ожидаемой точностью и неопределенностью измерения необходима воспроизводимость двух повторных исследований (см. приложение F).

6.3.5 Исследование концентрации сперматозоидов

Из тщательно перемешанного образца спермы берут аликвоту объемом 50 или 100 мкл (точный объем набирают с помощью поршневого дозатора) в зависимости от предполагаемой концентрации сперматозоидов (см. приложение E).

Аликвоту разбавляют (см. приложение E; объем зависит от результатов исследования влажного препарата) для иммобилизации сперматозоидов и достижения концентрации, которую можно с уверенностью подсчитать на гемоцитометре.

Тщательно перемешанную аликвоту суспензии сперматозоидов загружают в одну сторону счетной камеры. Вторую точно так же перемешанную аликвоту из той же суспензии сперматозоидов загружают в другую сторону счетной камеры. Затем счетную камеру оставляют в горизонтальном положении не менее чем на 10 мин во влажной камере, чтобы обеспечить осаждение сперматозоидов на сетке счетной камеры. Если прошло более 20 мин, необходимо проверить влажность в камере.

Исследование второй части аликвоты проводят путем сравнения не менее 200 сперматозоидов в каждом повторе, за исключением тех случаев, когда подсчет невозможен, например концентрация сперматозоидов менее 1 миллиона на миллилитр.

Рекомендуется использовать не менее 200 сперматозоидов в повторностях для снижения погрешности измерения (95%-ный доверительный интервал) до не более +/- 10%. Если оценивают не менее 100 сперматозоидов в повторе, соответствующая погрешность измерения составляет не более +/- 14%. Любой результат, основанный на менее чем 200 наблюдаемых сперматозоидах, должен быть прокомментирован в протоколе.

Для вычисления результата с ожидаемой точностью и неопределенностью измерения необходима воспроизводимость двух повторных исследований (см. приложение G).

6.3.6 Исследование отсутствия сперматозоидов

Тщательный, систематический визуальный осмотр (увеличение от 200^x до 400^x; сканирование всей области под покровным стеклом размером 22 x 22 мм) двух независимых аликвот по 10 мкл без обнаружения сперматозоидов в счетной камере является первой частью исследования. Вторая часть представляет собой осмотр всей площади счетной камеры, содержащей 10 мкл осадка всего эякулята после центрифугирования (1000 x g, 15 мин), под покровным стеклом размером 22 x 22 мм. Если сперматозоиды не обнаружены ни при одном из этих визуальных осмотров, считают достаточным, чтобы клиническая лаборатория подтвердила, что эякулят вряд ли содержит сперматозоиды, хотя присутствие случайных сперматозоидов не может быть исключено (см. приложение A).

6.3.7 Оценка жизнеспособности сперматозоидов

Жизнеспособность сперматозоидов обычно не исследуют в эякуляте, а только если при исследовании влажного препарата выявлен низкий процент подвижных сперматозоидов, например менее 40% общей подвижности.

Используют валидированный и проверенный метод для определения живых и мертвых сперматозоидов, например: тщательно перемешанная сперма, смешанная с комбинированным суправитальным красителем с фоновым красителем, такими как эозин Y и нигрозин [2] (см. приложение H).

Примечание - Тест на жизнеспособность только с эозином валидирован только для отрицательной фазово-контрастной микроскопии.

 

6.3.8 Исследование морфологии сперматозоидов

Мазки для исследования морфологии сперматозоидов рекомендуется готовить в течение 60 мин после сбора эякулята (см. приложение I). Продолжительное воздействие разжиженного эякулята может увеличить наличие скрученных хвостов сперматозоидов из-за постоянного увеличения осмоляльности эякулята.

Каждый сперматозоид должен быть исследован в отношении наличия аномалий головки, шейки и средней части, хвоста сперматозоида и остаточной цитоплазматической массы (см. приложение I). Для исследования подходят только цельные сперматозоиды (с головкой и хвостом). Если на 100 цельных сперматозоидов приходится более 20 незакрепленных головок, количество незакрепленных головок указывают отдельно как количество незакрепленных головок на 100 цельных сперматозоидов.

Для проведения исследований морфологии сперматозоидов необходимо обучение специалистов с использованием контрольных материалов (например, мазки, окрашенные красителем по Папаниколау или другими валидированными методами с подтвержденными результатами). Без этого обучения, а также постоянной проверки компетентности персонала результаты исследований не будут иметь научной и клинической значимости.