ГОСТ Р ИСО 11737-1-2022. Национальный стандарт Российской Федерации. Стерилизация медицинской продукции. Микробиологические методы. Часть 1. Определение популяции микроорганизмов на продукции
Приложение B
(справочное)
РУКОВОДСТВО
ПО МЕТОДАМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ НАГРУЗКИ
B.1 Общие положения
B.1.1 Определение биологической нагрузки может быть использовано в разных ситуациях. Лицо, ответственное за порядок проведения процесса подобного рода определений, должно принимать во внимание, в какой степени необходимы разработка и валидация метода. Кроме того, следует учитывать конкретные обстоятельства, при которых проводят процессы определения, например: частоту отбора проб, используемый метод, характеристику питательных сред и соответствующие условия инкубации.
B.1.2 Последовательность ключевых этапов процесса определения биологической нагрузки приведена на рисунке B.1. Лицо, ответственное за проведение процесса таких определений, должно использовать знания о сырье, компонентах, производственной среде, производственных процессах и характере продукта для выбора соответствующих методов для различных этапов. Для правильной разработки и последующей валидации метода возможно, что первоначально потребуется использовать комбинацию различных методов, чтобы установить метод(ы), наиболее подходящий(ие) для рутинного использования.
Рисунок B.1 - Последовательность ключевых этапов процесса
определения биологической нагрузки
B.2 Методы, в которых использовано извлечение микроорганизмов элюированием
B.2.1 Общие положения
B.2.1.1 Несколько методов, представленных в настоящем приложении, могут быть объединены для увеличения числа обнаруженных микроорганизмов и уменьшения изменчивости.
B.2.1.2 Степень адгезии микроорганизмов к поверхностям зависит от характера поверхности, включенных микроорганизмов и других присутствующих материалов (например, смазочных материалов). Происхождение контаминации также будет влиять на степень адгезии. Чтобы извлечь микроорганизмы, используемые процедуры могут состоять из промывки с применением физической силы или прямого отбора проб данной поверхности. Поверхностно-активное вещество может быть использовано для повышения извлечения, но следует признать, что поверхностно-активные вещества в высоких концентрациях могут оказывать ингибирующее действие.
B.2.1.3 Для материалов, контактирующих с нестерильными жидкостями, микроорганизмы могут возникать в виде биопленки, если не будут приняты соответствующие меры контроля биологической нагрузки. Биопленка - это структура, в которой микроорганизмы инкапсулированы в матрицу, прочно прилегающую к поверхности. Микроорганизмы в биопленках могут проявлять повышенную устойчивость к процессам стерилизации. Биопленки могут появляться и быстро развиваться в большей степени на медицинских продуктах, содержащих ткани, или на используемых изделиях. В таких случаях следует учитывать потенциал образования биопленки и не следует предполагать, что методы обработки, перечисленные в B.2.2, будут пригодны для полного освобождения микроорганизмов от биопленки. Указание на наличие биопленки может быть получено во время валидации метода удаления, если при повторном восстановлении регистрируется повторное высокое количество микробов. Высокий уровень эндотоксина также может быть признаком присутствия биопленки.
B.2.1.4 Любая обработка, используемая при определении биологической нагрузки, должна быть воспроизводимой, и, кроме того, следует избегать тех условий, которые могут повлиять на жизнеспособность микроорганизмов, таких как чрезмерная кавитация, поперечные силы, повышение температуры или осмотический шок.
B.2.1.5 Некоторые методы обработки легче контролировать, чем другие. Переменные процесса обработки и способы их контроля следует учитывать при выборе обработки и разработке подходящих условий обработки. Например, для данной обработки может быть увеличено время или характер механического перемешивания может быть изменен, чтобы увеличить извлечение микроорганизмов.
B.2.1.6 Некоторые методы обработки могут дезагрегировать исследуемый продукт (например, дезинтеграция, обработка в стоматере отмыванием и вихревое перемешивание). Наличие дезагрегированного материала может затруднить подсчет микроорганизмов. Возможна дополнительная обработка, например для отделения дезагрегированного материала от элюента. Следует проследить за тем, чтобы полученные подсчеты были репрезентативными. Некоторые виды микроорганизмов более склонны к агрегации/реагрегации, чем другие, основанные главным образом на их относительной гидрофобности.
B.2.1.7 Необходимо как можно быстрее передать образцы для испытаний в лабораторию. Если задержка в передаче неизбежна, то следует выбрать такие условия хранения, которые соответствуют установленным и которые позволяют свести к минимуму изменения в микробной популяции. Следует указать максимальное время хранения. Высушивание может быть причиной значительного снижения численности микроорганизмов и должно быть учтено при выборе условий и сроков хранения.
B.2.2 Методы извлечения
B.2.2.1 Обработка в стоматере отмыванием
B.2.2.1.1 Испытуемый образец и указанный объем элюента помещают в стерильный пакет.
Возвратно-поступательные лопасти воздействуют на пакет, выталкивая элюент через образец и вокруг него.
B.2.2.1.2 Должно быть определено время обработки.
B.2.2.1.3 Этот метод особенно подходит для мягких, волокнистых и/или абсорбирующих материалов, но непригоден для любых материалов, которые могли бы проколоть пакет (например, устройства, содержащие иглы или жесткие предметы).
B.2.2.1.4 Этот метод может дать суспензию с низкой концентрацией микроорганизмов, если используется относительно большой объем элюента. Если это практически возможно, элюент следует отфильтровать.
B.2.2.2 Ультразвуковое исследование
B.2.2.2.1 Испытуемый предмет погружают в указанный объем элюента в подходящем сосуде. Либо сосуд и его содержимое обрабатывают в ультразвуковой ванне, либо ультразвуковой зонд погружают в содержащийся в нем элюент. Микроорганизмы также могут быть инактивированы ультразвуком, особенно с большей передачей энергии, и инактивация более вероятна при использовании зонда, чем в ультразвуковой ванне. Оценку метода ультразвукового испытания следует проводить в соответствии с B.9.
B.2.2.2.2 Следует определить номинальную частоту ультразвукового воздействия и продолжительность обработки. Кроме того, должно(ы) быть определено(ы) положение(я), в котором(ых) предметы помещают в ультразвуковую ванну. Следует рассмотреть вопрос об ограничении количества предметов, подлежащих одновременной обработке, поскольку имеющаяся мощность ультразвука может быть уменьшена за счет экранирования.
B.2.2.2.3 Этот метод особенно подходит для твердых непроницаемых предметов и предметов сложной формы. Он может быть разрушительным для некоторых медицинских продуктов, особенно тех, которые содержат электронные компоненты, такие как имплантируемые генераторы импульсов.
B.2.2.2.4 Энергия ультразвука и продолжительность воздействия не должны вызывать разрушения и гибели микроорганизмов или перегрев элюента.
B.2.2.3 Встряхивание (механическое или ручное)
B.2.2.3.1 Испытуемый образец погружают в указанный объем элюента в подходящем сосуде и встряхивают на механическом шейкере (например, возвратно-поступательного, орбитального или запрокидываемого действия) в течение определенного времени/числа циклов, чтобы способствовать извлечению микроорганизмов. Можно использовать ручное встряхивание, но его эффективность может варьироваться в зависимости от оператора.
B.2.2.3.2 Должны быть определены время и частота встряхивания.
B.2.2.3.3 Стеклянные шарики определенного размера могут быть добавлены для увеличения поверхностного трения и, таким образом, эффективности восстановления биологической нагрузки. Размер добавленных стеклянных шариков, а также время и частота встряхивания не должны быть такими, чтобы вызывать перегрев и/или возможное повреждение микроорганизмов.
Примечание - Добавление стеклянных шариков увеличит площадь поверхности, к которой могут прилипать микроорганизмы.
B.2.2.4 Вихревое перемешивание
B.2.2.4.1 Испытуемый образец погружают в закрытый контейнер, содержащий указанный объем элюента, на который воздействует вращающаяся лопатка вихревого смесителя таким образом, чтобы создавался вихрь. Создаваемый вихрь будет зависеть от давления, приложенного вручную. Изменения в вихре могут вызывать изменения в процессе извлечения микроорганизмов.
B.2.2.4.2 Должны быть выбраны определенная емкость, которая будет использована, время перемешивания и скорость миксера.
B.2.2.4.3 Применение этого метода непродолжительно по времени и не вызывает затруднений при исполнении, но в основном подходит для небольших предметов в небольших контейнерах. Оценка различий в удалении должна быть проведена у разных людей, работающих с вихревым смесителем.
B.2.2.5 Смывание
B.2.2.5.1 Элюент пропускают через внутренние полости испытуемого образца. Поток жидкости может быть вызван гравитацией или перекачкой либо с помощью насоса. В качестве альтернативы предмет может быть заполнен элюентом, зажат и перемешан.
Следует определить время контакта изделия с элюентом, скорость промывки и объем жидкости.
B.2.2.5.2 Конфигурация изделия и размеры просвета могут ограничивать физические усилия, необходимые для полного удаления микроорганизмов с внутренних поверхностей.
B.2.2.6 Смешивание (дезинтеграция)
B.2.2.6.1 Испытуемый предмет погружают в указанный объем элюента в подходящей емкости. Этот предмет перемешивают или измельчают в течение определенного времени.
B.2.2.6.2 Указанное время зависит от предмета и смесителя, но не должно быть продлено, например, вызвав перегрев элюента и возможное повреждение микроорганизмов.
B.2.2.6.3 Этот метод обеспечивает способ разделения предмета на достаточно мелкие части, чтобы микроорганизмы могли быть подсчитаны методом заливки агаром.
B.2.2.7 Отбор проб с использованием тампонов
B.2.2.7.1 Тампоны состоят из абсорбирующего материала, который обычно крепят на форме в виде палочки или рукоятки. Материал для отбора проб может быть растворимым или нерастворимым.
B.2.2.7.2 Обычный метод использования заключается в том, чтобы смочить тампон элюентом и протереть заранее определенную площадь поверхности предмета. Эффективность восстановления биологической нагрузки в некоторых случаях может быть повышена за счет предварительного увлажнения поверхности, а затем протирания ее сухим тампоном. Тампон переносят в разбавитель и встряхивают для удаления микроорганизмов из тампона. В качестве альтернативы тампон растворяется в разбавителе - в случае растворимых тампонов.
B.2.2.7.3 Тампоны - это полезный метод отбора проб неправильной формы или наличия труднодоступных участков. Они также необходимы при отборе проб на большой площади.
B.2.2.7.4 Этот метод особенно подвержен ошибкам из-за различий в способе манипулирования тампоном. Кроме того, маловероятно, что все микроорганизмы на поверхности будут собраны тампоном. Некоторые из собранных микроорганизмов могут попасть в матрицу самого тампона, вследствие чего восстановление с помощью данного метода, как правило, является низким.
B.2.2.7.5 В тампоне не должно быть микробоцидных или микробостатических агентов.
B.2.3 Элюенты, разбавители и транспортные среды
B.2.3.1 Во время определения биологической нагрузки элюенты могут быть использованы для извлечения микроорганизмов из продукта. Транспортные среды могут быть применены для переноса извлеченных микроорганизмов для подсчета, а разбавители - для получения суспензий, содержащих микроорганизмы в счетном количестве.
B.2.3.2 Свойства элюентов и разбавителей могут оказывать заметное влияние на общую эффективность используемого метода. При выборе разбавителя или элюента следует учитывать их состав (например, составляющие компоненты и их концентрации, осмотическое давление и pH). При наиболее благоприятном варианте состав должен быть таким, чтобы не происходило пролиферации или инактивации микроорганизмов, однако это может оказаться невозможным установить для всех потенциальных контаминантов.
B.2.3.3 При использовании жидкости для извлечения микроорганизмов с твердых поверхностей можно добавить мягкое поверхностно-активное вещество (см. таблицу B.1).
Таблица B.1
Примеры элюентов и разбавителей
Раствор | Концентрация в воде | Применение |
Буферизованный раствор хлорида натрия-пептона | 0,067 М фосфат, 0,43% хлорид натрия, 0,1% пептон | Общие положения |
Калгон Рингера | 1/4 прочности | Растворение альгинатных тампонов кальция |
Пептонная вода | От 0,1% до 1,0% | Общие положения |
Фосфатно-солевой буфер | 0,02 М фосфата, 0,9% хлорид натрия | Общие положения |
Раствор Рингера | 1/4 прочности | Общие положения |
Хлорид натрия | От 0,25% до 0,9% | Общие положения |
Тиосульфат Рингера | 1/4 прочности | Нейтрализация остаточного хлора |
Вода | N/A | Разбавление водных проб. Приготовление изотонических растворов растворимых веществ перед подсчетом |
Примечание - Данный перечень не является исчерпывающим. Поверхностно-активное вещество, такое как полисорбат 80, может быть добавлено к элюентам и разбавителям. Обычно используют концентрацию от 0,1% до 1,0%, в зависимости от конкретного применения. Выбор подходящей концентрации в конкретной ситуации должен быть тщательным, поскольку может произойти вспенивание. | ||
B.2.3.4 Обычно используемые элюенты и разбавители включают элюенты, приведенные в таблице B.1.
B.3 Методы, при которых извлечение микроорганизмов элюированием не используют
B.3.1 Контактное покрытие
B.3.1.1 Контактные пластины или предметные стекла - это средства, с помощью которых затвердевшая питательная среда может прижиматься к поверхности для того, чтобы жизнеспособные микроорганизмы прилипли к поверхности среды. Затем пластину или предметное стекло можно инкубировать для подсчета полученных колоний.
B.3.1.2 Преимущество таких систем в том, что они просты в использовании. Результаты непосредственно связаны с областью контакта с затвердевшей питательной средой.
B.3.1.3 Потенциальными недостатками являются естественное скопление клеток на поверхности, распространение колоний на границе агара, высыхание агара и возможность анаэробного расположения.
B.3.1.4 Этот метод следует использовать только тогда, когда другие методы неприменимы, поскольку эффективность, как правило, низкая. Контактные пластины и предметные стекла обычно используют только на плоских или по крайней мере стандартных поверхностях.
B.3.2 Покрытие агаром
B.3.2.1 Покрытие агаром включает покрытие поверхности продукта расплавленной агаровой средой и позволяет ему затвердеть с последующей инкубацией для получения видимых колоний. Этот метод обычно не используется, но может быть применим, когда биологическая нагрузка низкая и когда подходит конфигурация продукта.
B.3.2.2 Потенциальными недостатками являются естественное скопление клеток на поверхности, распространение колоний на границе агара, высыхание агара и возможность наличия анаэробов. Кроме того, некоторые микроорганизмы не обязательно сохранятся в жизнеспособном состоянии после покрытия агаром при неблагоприятной температуре, что может привести к ложноотрицательным результатам или помешать правильной оценке.
B.3.3 Метод с наиболее вероятным числом (НВЧ)
B.3.3.1 Метод НВЧ - это положительно зарекомендовавший себя и полностью документированный метод оценки количества жизнеспособных микроорганизмов в том продукте, в котором микроорганизмы распределены случайным образом. Этот метод особенно подходит для продукта, имеющего биологическую нагрузку с низким средним числом.
B.3.3.2 Метод заключается в отборе реплицированных проб продукта (по объему или весу), содержащих в среднем одинаковое количество жизнеспособных микроорганизмов в каждой пробе/подпробе (требование рандомности распределения), и в индивидуальной оценке каждой выборки на предмет наличия жизнеспособных микроорганизмов путем пересева на жидкие питательные среды и инкубации. Как правило, подходят такие же питательные среды и условия, как и в ИСО 11737-2, в течение семи дней. Ряд разведений может быть инокулирован в питательную среду таким образом, чтобы часть инокулированной среды не производила видимого роста при последующей инкубации. По частоте проявления положительных тестов в наборе повторений оценивают количество жизнеспособных микроорганизмов, присутствующих в образце или массовом продукте, из которого взят образец; 95%-ные доверительные пределы оценки относительно широки. Оценка и ее доверительные пределы получены из опубликованных таблиц НВЧ [26], которые разработаны в предположении того, что число жизнеспособных микроорганизмов, присутствующих в реплицированных образцах, распределено вокруг среднего числа в соответствии с распределением Пуассона. FDA BAM, приложение 2 [27], включает электронную таблицу для расчета НВЧ с доверительной вероятностью 95%.
B.3.3.3 Ключевым требованием для применения метода НВЧ является рандомное распределение микробной популяции по всему исследуемому продукту. Соответственно, метод НВЧ может быть необходим при определении биологической нагрузки для жидких медицинских продуктов, вязких жидкостей, порошков или в тех ситуациях, когда биологическая нагрузка оценивается в жидкости, используемой в качестве элюента для одного продукта.
B.3.3.4 Методы НВЧ доступны в исполнении, но статистическое обоснование метода делает его более подходящим для общей оценки популяции, а не для точного определения. Метод НВЧ для 10 образцов однократного разведения показан в FDA BAM, таблица 5 [27]. Данный метод однократного разведения не предусматривает выполнения дополнительных разведений, которые могут предоставить дополнительную информацию о количестве микроорганизмов на положительном образце. Для отдельных проб или ЧПИ в качестве альтернативы для определения НВЧ может быть использована формула (B.1), которая является упрощенной версией оригинальной формулы Кохрена [42]:
где sd - однократное разведение; ln - натуральный логарифм; n - общее число образцов в испытании; s - чисто образцов для отрицательного контроля роста. |
|
(B.1)B.3.3.5 Результаты НВЧ на продукте могут быть приравнены к результатам КОЕ на продукт для подсчета и расчетов биологической нагрузки.
B.3.3.6 Если присутствуют микробоцидные или микробостатические вещества, то будут применены решения, изложенные в B.8.
B.4 Перенос на питательную среду
B.4.1 Общие положения
B.4.1.1 Обработка, как правило, приводит к образованию суспензии микроорганизмов. Подсчет жизнеспособных микроорганизмов в суспензии можно провести с помощью одного из методов, описанных ниже.
B.4.1.2 Перед переносом на питательную среду может потребоваться дополнительная обработка, чтобы разрушить агрегацию микроорганизмов и тем самым уменьшить недооценку. В некоторых случаях метод извлечения микроорганизмов из исследуемого образца также может разрушить такие агрегаты.
B.4.1.3 Наличие микробоцидных или микробостатических веществ будет влиять на выбор метода культивирования. Если в элюенте присутствуют микробоцидные или микробостатические вещества, их количество можно уменьшить до неэффективной концентрации путем разбавления, удаления фильтрацией или химической инактивацией.
B.4.2 Мембранная фильтрация
B.4.2.1 Фильтрация элюента с последующей инкубацией фильтра на соответствующей питательной среде для получения видимых колоний является эффективным средством подсчета жизнеспособных микроорганизмов. Фильтр с соответствующим номинальным размером пор не более 0,45 мкм обычно достаточен для улавливания микроорганизмов, однако следует рассмотреть возможность использования меньшего размера пор, если микроорганизмы, присутствующие на/в продукте, гарантированно меньшего размера.
B.4.2.2 Как правило, требуется источник вакуума или в некоторых случаях источник давления. Следует соблюдать осторожность во избежание чрезмерного противодавления, которое может привести к искажению или повреждению мембранного фильтра.
B.4.2.3 Мембранная фильтрация элюентов, содержащих твердые частицы, такие как остатки волокнистых продуктов, может быть затруднена, так как твердые частицы могут блокировать фильтр.
B.4.2.4 Для инкубации мембранный фильтр может быть помещен либо на поверхность агара, либо на абсорбирующую прокладку, насыщенную жидкой питательной средой. Колонии, образующиеся на поверхности мембранного фильтра, подсчитывают и выделяют для микробиологической характеристики.
B.4.2.5 Мембранная фильтрация особенно востребована для суспензий с низкими концентрациями микроорганизмов.
B.4.2.6 Фильтрация также востребована, когда жидкий субстрат проверяют на предмет содержания микробоцидных или микробостатических веществ, так как микроорганизмы удаляются из элюента и могут быть промыты на мембранном фильтре перед инкубацией. Некоторые типы мембран могут поглощать или выделять те вещества, которые могут ингибировать рост микроорганизмов, поэтому необходимо использовать только мембранные фильтры, пригодные для подсчета микроорганизмов. Мембранный фильтр и элюент должны быть совместимы.
B.4.3 Посев на чашки методом заливки (глубинным способом)
B.4.3.1 При использовании метода посева на чашки методом заливки отдельные аликвоты (определенное количество данного разведения) суспензии смешивают с расплавленной агаровой средой при температуре приблизительно 45 °C; затем смеси дают затвердеть в чашке Петри. Чашки инкубируют и подсчитывают колонии.
B.4.3.2 Посев на чашки методом заливки не отделяет микроорганизмы от элюента. Если микробоцидные или микробостатические вещества присутствуют, будут применены решения, изложенные в B.8.
B.4.3.3 Количество элюента, которое может быть внесено в чашки, ограничено. Поэтому этот метод может не иметь предпочтительной чувствительности для суспензий с низкими концентрациями микроорганизмов.
B.4.3.4 Необходимо поддерживать температуру агара как можно ниже, чтобы избежать повреждения микроорганизмов, поскольку даже температура 45 °C может инактивировать некоторые микроорганизмы окружающей среды. Таким образом, заливочное покрытие имеет ограничения по типам микроорганизмов, которые могут быть обнаружены, хотя модификации с использованием карбоксиметилцеллюлозы в качестве регулятора могут быть возможны в особых случаях.
B.4.4 Посев на поверхность чашек
B.4.4.1 При использовании метода посева на поверхность чашек аликвоту суспензии распределяют по поверхности питательной среды с помощью распределяющего устройства.
B.4.4.2 Аликвота (определенное количество данного разведения) суспензии, которая распределена по поверхности среды, должна быть поглощена таким образом, чтобы могли развиться отдельные колонии; потребность в поглощении определяет объем аликвоты, который может быть обработан при использовании одной чашки.
B.4.4.3 Если присутствуют микробоцидные или микробостатические вещества, то будут применены решения, изложенные в B.8.
B.4.4.4 Количество элюента, которое может быть нанесено на чашку с агаром, ограничено. Поэтому этот метод может не иметь предпочтительной чувствительности для суспензий с низкими концентрациями микроорганизмов.
B.4.5 Спиральный метод посева
B.4.5.1 В технике спирального посева на чашку используют автоматизированное оборудование, которое распределяет аликвоту (суспензии) на поверхность твердой среды. Суспензия распределяется с уменьшающейся скоростью по спиральной дорожке от центра культуральной чашки к периферии. После соответствующей инкубации подсчет жизнеспособных микроорганизмов в исходной суспензии осуществляют с использованием определенной счетной сетки и метода подсчета, при котором основой для расчетов является общее количество чашек или секторов.
B.4.5.2 Установлено, что спиральный метод посева дает воспроизводимые результаты, наиболее приемлемым образом коррелирующие с теми, которые применяют при использовании обычных методов последовательного разбавления и поверхностного растекания. Благодаря конструкции аппарата и использованию капиллярных трубок и небольших объемов спиральное покрытие в первую очередь поддается инокуляции суспензиями, которые распределены надлежащим образом, свободны от агрегатов материала и содержат высокую концентрацию микроорганизмов.
B.4.5.3 Если присутствуют микробоцидные или микробостатические вещества, то будут применены решения, изложенные в B.8.
B.5 Инкубация (питательные среды и условия инкубации)
B.5.1 Примеры некоторых питательных сред и условий инкубации приведены в таблице A.2. Этот перечень не является исчерпывающим, и определение типа(ов) биологической нагрузки микроорганизмов, присутствующих на продукте, в том числе молекулярным путем, может спровоцировать включение или исключение этих или многих других сред для микробной культуры.
B.5.2 Следует отметить, что все методы неселективного культивирования анаэробов могут позволить также выявить рост факультативных аэробных микроорганизмов. Однако спектр таких микроорганизмов может значительно варьироваться при различных питательных средах и условиях инкубации.
B.6 Перечисление (подсчет колоний)
B.6.1 В методике перечисления подсчета колоний, использующей подсчет колоний, должны быть установлены процедуры для решения различных задач, таких как:
a) обнаружение небольших колоний (например, с помощью стереомикроскопа);
b) подсчет и отчетность о необычных колониях (например, ползущий рост);
c) подсчет и отчетность о переполненных чашках [например, затемненные колонии или слишком многочисленное количество для проведения подсчета (TNTC) чашки] и
d) подсчет результатов серийных разведений.
B.6.2 В методике подсчета, использующей подсчет колоний, следует учитывать количество колоний, выросших на чашках. Это число должно быть таким, чтобы каждый жизнеспособный микроорганизм мог выражать себя как видимая колония, не подвергаясь негативному воздействию со стороны других микроорганизмов, граничащих с ними.
B.6.3 Стандартная практика подсчета чашек обычно устанавливает нижний предел для количества колоний на чашке. Этот предел основан на наличии нескольких разведений, из которых можно произвести выборку. Необязательно применять многократные разведения для определения биологической нагрузки для медицинского продукта, в котором биологическая нагрузка низкая.
B.6.4 При подсчете чашек следует оценивать различия в результатах в зависимости от технического персонала. Для примера ссылки на допустимые различия между техническими специалистами - см. "Стандартные методы. 9215 Подсчет гетеротрофных пластин".
B.6.5 Наличие волокон может препятствовать образованию дискретных колоний и тем самым затруднять их подсчет.
B.6.6 Использование слоя агара, вылитого и распределенного на поверхности исследуемой чашки, может показать тот результат испытания, который легче пересчитать после инкубации, если присутствуют ползущие микроорганизмы.
B.6.7 Для автоматизированных методов подсчета валидацию системы следует выполнять в соответствии с ИСО/МЭК 17025.
B.6.8 Если использовано несколько условий испытания (например, подсчет аэробных бактерий с одной чашки и подсчет грибов с другой чашки) и колонии не восстанавливаются, то значения LOD являются кумулятивными. Например, если количество аэробов < 2 КОЕ и грибов < 2 КОЕ, то общее количество составляет < 4 КОЕ.
B.7 Другие методы обнаружения микроорганизмов
Методы, отличные от подсчета колоний, могут быть использованы для определения биологической нагрузки. К ним относят измерения метаболической активности (например, импедиометрия или эпифлуоресценция). Такие методы называются косвенными, потому что для того, чтобы получить значение относительно количества жизнеспособных микроорганизмов, как это было определено ранее, они должны быть откалиброваны по количеству колоний. Альтернативные методы должны обладать достаточной чувствительностью для обнаружения низких уровней микроорганизмов. Как правило, нижний предел обнаруженных чисел превышает 100 КОЕ.
Примечание - Некоторые быстрые микробиологические методы (например, биолюминесценция, ферментативная цитометрия) могут предоставить подробную информацию о диапазоне и относительном количестве микроорганизмов, присутствующих биологической нагрузке, и позволяют оценить возможную изменчивость. Они также могут предоставлять информацию об биологической нагрузке быстрее, чем прямое культивирование.
B.8 Скрининг на высвобождение веществ, влияющих на определение биологической нагрузки
B.8.1 Скрининг направлен на изучение влияния на жизнеспособность потенциально уязвимых микроорганизмов веществ, которые могут выделяться из изделия в суспендирующую жидкость. Этот пример может быть использован для оценки метода в соответствии с 6.1.2.
B.8.2 После отбора изделий каждый из них должен быть подвергнут методике извлечения микроорганизмов, которая в дальнейшем будет использована на регулярной основе. Если при методе извлечения применен элюент, то могут руководствоваться требованиями B.8.3; если изделие вводят непосредственно в среду, то требования B.8.4 могут быть более предпочтительными.
B.8.3 Элюент не должен подавлять рост микроорганизмов, извлеченных из изделия.
B.8.4 Если изделие должно быть введено непосредственно в питательную среду (например, как при оценке НВЧ; см. B.3.3), то можно использовать исследование на пригодность метода, описанного в фармакопеях. В этом исследовании изделие вводят в среду вместе с небольшим количеством микроорганизмов и инкубируют в тех же условиях, что и для обычного определения бионагрузки. Количество используемых микроорганизмов должно быть примерно от 50 до 100 (см. B.8.5 для оценки результатов). Через определенный период среду исследуют на видимый рост.
Если медицинская продукция содержит антимикробное вещество, которое может медленно высвобождаться в среду, то в конце инкубационного периода целесообразно подвергнуть испытанию сочетания промежуточного изделия с низким количеством микроорганизмов.
B.8.5 Если количество инокулированных и восстановленных микроорганизмов существенно различается или рост микроорганизмов в исследовании на пригодность не наблюдается, то методику определения уровня биологической нагрузки следует пересмотреть. Может потребоваться введение стадии разбавления, нейтрализации или фильтрации для уменьшения, инактивации или удаления ингибирующего(их) вещества (веществ).
Если необходимо оценить воздействие элюента, то указанное количество микроорганизмов может быть инокулировано как в элюент, так и в контрольный раствор в течение времени, приблизительно равного используемому для обычной бионагрузки. Выделенные из элюента микроорганизмы подсчитывают в конце этой обработки и сравнивают с подсчетами из контрольного раствора.
B.9 Скрининг на неблагоприятные последствия физической нагрузки
Для удаления микроорганизмов из изделия можно использовать физические процессы (см. B.2.2). Следует принимать во внимание влияние этих процессов на определение биологической нагрузки. Если необходимо оценить воздействие физических процессов, то установленные низкие числа (не более 100 КОЕ) должны подвергаться воздействию тех физических процессов, которые будут использованы при отсутствии устройства. Подсчет микроорганизмов дает меру воздействия физических процессов.
Подписаться на обновления