ГОСТ Р ИСО 11737-1-2022. Национальный стандарт Российской Федерации. Стерилизация медицинской продукции. Микробиологические методы. Часть 1. Определение популяции микроорганизмов на продукции
Приложение A
(справочное)
РУКОВОДСТВО
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ПОПУЛЯЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ В ПРОДУКТЕ
Примечание - Для удобства пользования нумерация в настоящем приложении соответствует нумерации, используемой в основной части настоящего стандарта.
A.1 Рекомендации, связанные с областью применения
В настоящем приложении приведены рекомендации по выполнению требований, указанных в настоящем стандарте. Данное руководство не претендует на то, чтобы быть исчерпывающим, но должно подчеркнуть существенные аспекты, на которые следует обратить внимание.
Могут быть использованы методы, отличные от приведенных в настоящем приложении, но эти альтернативные методы должны быть продемонстрированы как эффективные для достижения соответствия требованиям настоящего стандарта.
Настоящее приложение не предназначено в качестве обязательных требований для оценки соответствия требованиям настоящего стандарта.
A.2 Взаимосвязанные с нормативными ссылками
Сведения отсутствуют.
A.3 Взаимосвязанные с терминами и определениями
Сведения отсутствуют.
A.4 Элементы системы менеджмента качества
Примечание - Настоящий стандарт не требует наличия полной системы менеджмента качества. Однако минимальные элементы системы менеджмента качества, необходимые для контроля определения биологической нагрузки, используемые при валидации и мониторинге медицинской продукции, подлежащей стерилизации, имеют ссылки на соответствующие пункты настоящего стандарта (см., в частности, раздел 4). Следует обратить внимание на стандарты систем менеджмента качества (см. ИСО 13485), которые контролируют все этапы производства или повторной обработки медицинского продукта.
A.4.1 Документация
В ИСО 13485 требования к документации относят к требованиям при разработке и контроле документации (включая спецификации и процедуры) и записей.
Компьютеры используют в лабораториях для прямого и косвенного сбора, обработки и/или хранения данных. Следует контролировать используемые для таких целей аппаратные средства и программное обеспечение.
Используемая компьютерная система должна быть идентифицирована с точки зрения как аппаратного, так и программного обеспечения, и любые изменения в любом из этих аспектов должны быть задокументированы и подлежать соответствующему утверждению.
Если расчеты выполняют с помощью электронных методов обработки данных, программное обеспечение (например, расчеты в электронных таблицах) должно быть проверено перед использованием, и записи об этой проверке должны быть сохранены.
Для программного обеспечения должна быть документация, описывающая следующее:
a) прикладное программное обеспечение, используемое в компьютерной системе;
b) операционное программное обеспечение;
c) используемые пакеты данных.
Все программное обеспечение должно быть проверено перед вводом в эксплуатацию.
Если компьютерное программное обеспечение разработано собственными силами, то должны быть разработаны и соответствующие процедуры для обеспечения следующего:
- сохранения документации по разработке, включая исходный код;
- сохранения записи приемо-сдаточных испытаний;
- документирования изменений в программах;
- документирования изменений в оборудовании и официального тестирования перед вводом в эксплуатацию.
Эти элементы управления также должны быть применены к любой модификации или настройке пакетов коммерческого программного обеспечения.
Должны быть процедуры, позволяющие обнаруживать и/или предотвращать несанкционированные изменения программного обеспечения.
Программы, посредством которых организуют, сводят в таблицы и/или подвергают данные статистическим или другим математическим процедурам либо иным образом манипулируют или анализируют хранящиеся в электронном виде данные, должны позволять извлекать исходные записи данных. Могут потребоваться специальные процедуры архивирования компьютерных данных, и эти процедуры должны быть задокументированы.
Требования к контролю документов и записей приведены в ИСО 13485, ИСО 15189 или ИСО/МЭК 17025; требования к технической документации - в ИСО/МЭК 17025.
Для руководства по применению систем менеджмента качества для компьютерного программного обеспечения см. также ИСО/МЭК 90003.
A.4.2 Ответственность руководства
В ИСО 13485 требования раздела "Ответственность руководства" касаются приверженности руководства ориентированности на потребителя, политики в области качества, планирования, ответственности, полномочий, коммуникации и проведения анализа со стороны руководства.
Данные, полученные при определении биологической нагрузки, должны быть надежными. Важно, чтобы определения биологической нагрузки проводились в контролируемых условиях. Следовательно, лабораторные помещения, используемые для этих определений, будь то на территории изготовителя медицинской продукции или являющиеся внешними, должны управляться и эксплуатироваться в соответствии с документированной системой качества.
В определении биологической нагрузки могут участвовать разные стороны, каждая из которых несет ответственность за конкретные элементы метода или процедуры (см. приложение D для руководства по типичным обязанностям). В настоящем стандарте установлены требования для стороны, принимающей на себя конкретные обязанности, которые должны быть оформлены документально в рамках системы (систем) менеджмента качества участвующих сторон. Сторона, ответственная за определенные элементы, обязана привлечь для исполнения данных обязательств персонал, компетентность которого подтверждается соответствующими подготовкой и квалификацией.
Если определение биологической нагрузки проводят в лаборатории под непосредственным руководством изготовителя медицинской продукции, то работа лаборатории осуществляется в рамках системы менеджмента качества производителя. Если используют внешнюю лабораторию, то все испытания следует проводить в соответствии с признанными действующими/действительными валидированными, наиболее эффективными лабораторными практиками (например, ИСО 15189, ИСО/МЭК 17025), где это применимо, и данные должны оцениваться компетентными специалистами.
Каждая лаборатория должна предоставлять качественные услуги, и это обязательство должно быть оформлено как политика в области качества. Порядок полномочий и ответственности в лаборатории должны быть официально установлены и задокументированы. Следует назначить сотрудника, ответственного за создание лабораторной системы качества, который должен обладать полномочиями для обеспечения внедрения этой системы.
Деятельность лаборатории должна подвергаться регулярным внутренним проверкам. Результаты аудита должны быть задокументированы и рассмотрены руководством лаборатории (см., например, ИСО 15189 или ИСО/МЭК 17025).
Требования к ответственности, полномочиям и человеческим ресурсам определены в ИСО 13485.
Требования к предоставлению ресурсов указаны в ИСО 13485; требования к оборудованию - в ИСО 15189 и ИСО/МЭК 17025.
A.4.3 Реализация продукции
В ИСО 13485 требования в разделе "Реализация продукции" отнесены ко всем циклам производства продукта, начиная с определения требований заказчика, проектирования и разработки, закупок, контроля производства и калибровки контрольно-измерительных приборов.
Должна существовать система определения требований к техническому обслуживанию каждой единицы лабораторного оборудования. Оборудование, не требующее калибровки, должно быть четко идентифицировано.
Любое оборудование или его части, которые вступают в контакт с продуктом, элюентом, питательными средами и т.д., во время тестирования должны быть стерильными. Все микробиологические среды и элюенты, используемые для удаления микроорганизмов из продукта, должны быть приготовлены таким образом, чтобы обеспечить их стерильность.
Соответствующие испытания качества питательных сред должны включать испытания на стимулирование роста. Как правило, испытания на стимулирование роста проводят с каждой партии при использовании инокулята с низким количеством [не более 100 колониеобразующих единиц (КОЕ)] отобранных микроорганизмов. Тесты на стимулирование роста приведены в некоторых фармакопеях [например, US Pharmacopoeia (USP), European Pharmacopoeia (EP)], подробно описывающих подходящие микроорганизмы. Приемлемы и другие действующие количественные и полуколичественные методы контроля качества сред.
Требования к закупкам приведены в ИСО 13485. В частности, следует отметить, что требования ИСО 13485 по проверке закупаемых изделий распространяются на все товары и услуги, полученные организацией извне.
Требования к калибровке контрольно-измерительных приборов изложены в ИСО 13485; требования к оборудованию и отслеживанию измерений - в ИСО/МЭК 17025.
A.4.4 Измерение, анализ и улучшение
A.4.4.1 Результаты испытаний биологической нагрузки, как правило, не укладываются в математическую модель распределения. Поэтому неопределенность измерений, точность и смещение могут быть не нужны, за исключением оценки общей компетентности лаборатории. При использовании методов испытаний биологической нагрузки измерение неопределенности, точности и смещения учитывают при определении эффективности восстановления биологической нагрузки.
A.4.4.2 Требования раздела ИСО 13485 "Измерение, анализ и улучшение" касаются мониторинга в процессе производства, контроля несоответствующих изделий, анализа данных и усовершенствований (включая корректирующие и предупреждающие действия).
Все результаты биологической нагрузки, которые превышают указанный уровень и/или указывают на неблагоприятную тенденцию, должны быть исследованы. Первый этап испытания должен включать оценку того, являются ли результаты истинными или ошибочными. Следующие факторы могут способствовать возникновению ошибки и должны быть устранены:
- неподходящие образцы (например, нерепрезентативные, неоднородные, бракованные материалы);
- неподходящие материалы для отбора проб (например, тампоны, контейнеры, упаковки);
- неподходящие условия транспортирования/обработки/хранения;
- несоответствующие испытательные материалы (например, неправильное хранение, использование пипеток, неисправность фильтрационного аппарата);
- неправильное обращение или метод(ы) испытаний;
- неподходящие питательные среды или растворители;
- неподходящая лабораторная среда;
- неподходящая инкубационная среда;
- ошибки вычисления или транскрипции;
- отклонение от метода испытания (например, ошибка разбавления, ошибка фильтрации, ошибка асептического метода).
Если результаты обусловлены отбором проб или лабораторной ошибкой, то результат биологической нагрузки, превышающий указанный уровень, должен быть проверен путем проведения другого определения с использованием новых образцов из той же партии изделия, если это возможно. Если продукт поддерживает рост микроорганизмов и может привести к недостоверным данным или если та же партия больше не доступна, следует использовать новую партию.
Если первоначальный результат подтверждается как истинный вывод, то, по крайней мере, следующее должно быть рассмотрено на втором этапе испытания:
a) значение результата по отношению к цели, для которой будут использованы данные (например, эффективность процесса стерилизации);
b) необходимость увеличения размера выборки и/или частоты;
c) оценка производственного процесса, направленная на решение следующих задач:
1) сырье/компоненты (например, поставщики, изменения качества),
2) очистка/смазка/производственная жидкость,
3) транспортирование/хранение контейнеров,
4) рабочие поверхности,
5) одежда персонала/гигиена/практика,
6) погрузочно-разгрузочные работы/сборка,
7) условия окружающей среды и результаты мониторинга (включая сезонные факторы, при их наличии),
8) упаковочные материалы и процедуры,
9) условия хранения;
d) микробиологическая характеристика выделенных микроорганизмов, включая:
1) потенциальные источники,
2) сравнение с предыдущими изолятами.
По результатам испытания могут потребоваться конкретные корректирующие действия. Если необходимы корректирующие действия, их эффективность должна быть продемонстрирована.
Процедуры корректирующих действий определены в ИСО 13485, ИСО 15189 и ИСО/МЭК 17025.
A.5 Отбор продукта
A.5.1 Общие положения
A.5.1.1 Процедуры отбора и обработки образцов продукта должны быть задокументированы и проведены во избежание непреднамеренной контаминации и значительных изменений количества и типов микроорганизмов в образце. Методы отбора проб должны быть последовательными с возможностью проведения сравнения биологической нагрузки за определенный период.
При выборе образцов продукта для определения биологической нагрузки существует несколько возможностей:
a) берут продукт (рандомно или с заданной частотой);
b) изготавливают продукт специально для тестирования биологической нагрузки с использованием стандартных производственных процедур;
c) берут продукт, который не подходит для продажи, может быть утилизирован или иным образом забракован.
Выбор может зависеть от ряда факторов, но первой предпосылкой является то, что выбранный продукт должен обладать биологической нагрузкой, репрезентативной для реального изделия. Если принято решение об утилизации бракованного изделия, то это изделие должно пройти все основные стадии производства, включая возможные процессы очистки и упаковки.
При отборе проб для определения биологической нагрузки продукт должен содержаться в обычной упаковке. Как правило, достаточно выполнить определение биологической нагрузки на/в продукте после его извлечения из упаковочной системы и исключить упаковочную систему из определения. В зависимости от содержания (информации) этикетки о стерильности внутренние компоненты упаковки, такие как лоток или вставка для продукта, могут быть подвергнуты испытаниям на основании таких факторов, как:
- то, что должно быть стерильным;
- когда упаковка является неотъемлемой частью продукта, или
- для конкретной оценки.
A.5.1.2 Использование данных биологической нагрузки (например, контроль сырья, прием входящих компонентов, оценка технологических стадий, квалификация процесса стерилизации) следует принимать во внимание при создании семейств продукта для определения биологической нагрузки. При создании семейств продукта для определения биологической нагрузки необходимо учитывать следующее:
a) природа и источник сырья;
b) природа и источник компонентов;
c) сложность производственного процесса, т.е. степень обработки, количество технологических этапов;
d) типы используемых производственных процессов;
e) производственная среда;
f) конструкция и размер продукта;
g) производственное оборудование;
h) место производства.
Кроме того, количество и типы микроорганизмов могут влиять на выбор метода испытания биологической нагрузки для данного семейства продукта. Для каждого семейства продукта следует выбрать основной продукт или репрезентативный(ые) продукт(ы) для стандартного определения биологической нагрузки. Выбор основного продукта должен быть обоснован документально.
Если продукты внутри семейства считают эквивалентными, то для определения биологической нагрузки может быть выбран репрезентативный продукт. Указанный продукт могут контролировать регулярно или могут быть выбраны другие представители группы на основе чередования. Если выбранный продукт контролируют регулярно, то следует периодически контролировать непрерывную эквивалентность других продуктов в семействе или предоставлять обоснование.
A.5.1.3 Если данные определения биологической нагрузки должны быть использованы для установления или поддержания процесса стерилизации, то период времени, прошедший между отбором образцов продукта и определением биологической нагрузки, должен быть репрезентативным для периода времени между завершением последнего этапа производства и стерилизацией продукта.
A.5.2 Часть продукта для испытания
A.5.2.1 При определении биологической нагрузки следует использовать весь продукт, хотя это может быть неосуществимо, если продукт не может быть помещен в имеющиеся лабораторные испытательные сосуды. В этом случае применяют ЧПИ. Следует учитывать распределение биологической нагрузки по всему изделию. Если предполагается, что распределение будет неравномерным по всему продукту, следует определить площадь наиболее предельно контаминированного продукта. Эта область должна быть включена в выбранную ЧПИ.
A.5.2.2 Для ЧПИ следует использовать как можно большую часть продукта. ЧПИ должна быть репрезентативной, чтобы можно было определить биологическую нагрузку всего продукта. Тщательный выбор ЧПИ для продукта необходим при тестировании крупных продуктов, таких как хирургические халаты или наборы наружного дренажа.
A.5.2.3 Следует учитывать аспекты производства, которые способствуют распространению микроорганизмов на продуктах.
A.5.2.4 Примерами ЧПИ, которые могут быть выбраны из изделий, более устойчивых к процессу стерилизации, являются наборы трубок с соединениями, запорными клапанами и т.д.
A.5.2.5 Примеры продукта, для которых используют различные основы расчета ЧПИ, приведены в таблице A.1.
Таблица A.1
Примеры расчета ЧПИ
Основа для ЧПИ | Продукт |
Площадь поверхности | Имплантаты (не рассасывающиеся) |
Масса | Порошки Халаты Имплантаты (рассасывающиеся) |
Длина | Трубка (постоянный диаметр) |
Объем | Жидкость в контейнере |
При подготовке или сборке ЧПИ следует соблюдать осторожность во время манипуляций с продуктами. Если части должны быть отделены от продукта, то это должно быть сделано в чистых условиях в контролируемой среде (например, внутри шкафа с ламинарным потоком), чтобы избежать дополнительной контаминации.
A.6 Методы определения и микробиологическая характеристика биологической нагрузки
A.6.1 Определение биологической нагрузки
A.6.1.1 Выбор подходящего метода
На рисунке A.1 представлена схема принятия тех решений, которые имеют общее применение на начальных этапах выбора метода определения биологической нагрузки. Данный рисунок может относиться ко всем методам.
Рисунок A.1 - Схема принятия решений при выборе метода
определения биологической нагрузки
Для продукта с высокой биологической нагрузкой, для которого использован метод культивирования, необходимо убедиться в том, что выполнено достаточное количество разведений для получения количественных результатов и предотвращения таких проблем, как маскировка колоний или слишком большое количество при подсчете пластин (TNTC).
Примечание 1 - Эта схема принятия решений не исключает использования альтернативных микробиологических экспресс-методов определения биологической нагрузки (например, автофлуоресценции, проточной цитометрии, прямой эпифлуоресценции, фильтрующей техники и твердофазной цитометрии).
Примечание 2 - Эта схема принятия решений не охватывает все типы продукта, которые могут быть исследованы, или все типы исследований, которые можно использовать.
Для продукта с предельно низкой биологической нагрузкой может оказаться невозможным восстановить обнаруживаемую биологическую нагрузку из отдельных единиц продукта, даже если использован подходящий метод испытания биологической нагрузки с проверенной эффективностью восстановления биологической нагрузки. Следует проявлять осторожность в отношении оценки средней биологической нагрузки при обнаружении нулевых колоний, чтобы избежать завышения истинной биологической нагрузки продукта. Предел обнаружения для метода испытаний биологической нагрузки должен отражать предполагаемое использование данных по биологической нагрузке, и, при необходимости, метод испытаний биологической нагрузки должен быть разработан таким образом, чтобы минимизировать предел обнаружения.
Для оптимизации методов определения биологической нагрузки для продукта с низкой биологической нагрузкой может потребоваться рассмотрение использования альтернативного метода. Примеры приведены в перечислениях a) - e).
a) Метод объединенных образцов, при котором несколько единиц продукта объединяют в одно испытание. Для этого метода должна быть определена эффективность восстановления биологической нагрузки. Общее количество извлекаемых КОЕ для объединенных образцов делится на количество объединенных единиц для оценки КОЕ на единицу. Объединение единиц позволит оценить низкое количество КОЕ на единицу, однако при этом отсутствует информация о распределении биологической нагрузки или изменчивости на отдельных единицах, составляющих объединенную выборку. Объединение может быть применимо в случаях последовательного количества КОЕ на единицу.
Следует помнить, что объединение образцов в резервуар может снизить возможность обнаружения непреднамеренных изменений в производственном процессе в зависимости от метода объединения.
b) Метод с наиболее вероятным числом (НВЧ) (см. B.3.3).
c) Комбинирование и элиминация испытаний, подходящие для групп микроорганизмов: для многих видов изделий отсутствует необходимость разбивать экстракт на части для отдельных испытаний, таких как аэробы, анаэробы, споры и грибки. Если оценка показала, что испытание на анаэробы не указано, то это испытание может быть исключено в будущем. Кроме того, если аэробные споры обнаруживают в подсчете аэробных бактерий, а количество грибов невелико, то можно объединить испытания на аэробные бактерии, бактериальные споры и грибковые в одно испытание, например: фильтрация всего объема экстракционной жидкости через один фильтр, помещенный на подходящую культуральную среду общего назначения, которую затем инкубируют при двух различных температурах (например, от 30 °C до 35 °C и от 20 °C до 25 °C). Другие примеры включают использование одной инкубации при температуре (30 +/- 2) °C или инкубации в других температурных диапазонах, подходящих для обнаружения конкретной микробной популяции. Устранение факторов разбавления таким образом (при условии, что устранение оправдано) может свести к минимуму вероятность завышения среднего значения биологической нагрузки.
d) Метод с половинным пределом обнаружения, способствующий вычислению среднего значения биологической нагрузки, когда в результатах биологической нагрузки присутствуют значения "меньше". Этот метод обеспечивает более низкий результат биологической нагрузки, когда меньший процент результатов составляет 0 КОЕ на пластину (дополнительная информация приведена в [24]).
e) Метод, основанный на распределении Пуассона, с установлением значений "меньше": это дает возможность определить оценку средней биологической нагрузки.
Биологическая нагрузка обычно не распределяется на продуктах в течение всего производственного процесса таким образом, чтобы ее можно было статистически проанализировать с помощью распределения Пуассона. Применение распределения Пуассона к биологической нагрузке должно быть тщательно рассмотрено в связи с предполагаемым использованием информации. (Для получения дополнительной информации см. [24] и [20].)
При выборе метода определения биологической нагрузки следует учитывать возможное появление биопленки на/в продукте. Биопленка может образовываться на/в продукте при контакте с жидкостями, если не будут приняты соответствующие меры контроля биологической нагрузки. Медицинская продукция, содержащая ткани, имеет возможность возникновения биопленки.
A.6.1.2 Нейтрализация ингибирующих веществ
См. приложение B.
A.6.1.3 Извлечение микроорганизмов
См. приложение B.
A.6.1.4 Культивирование микроорганизмов
Свойство сырья, способ изготовления и условия, при которых происходит изготовление продукта, являются факторами, влияющими на биологическую нагрузку продукта, и должны быть учтены при выборе питательных сред и условий инкубации. Если особые микроорганизмы отсутствуют, то подходят универсальные, неселективные питательные среды и условия инкубации. Рекомендации лаборатории при участии производителя по использованию стандартных условий культивирования биологической нагрузки могут быть достаточными в качестве рассмотрения и обоснования.
При выборе питательных сред и условий инкубации следует учитывать, по крайней мере, следующее:
a) ни одна комбинация, состоящая из среды и условий инкубации, не может поддерживать рост всех микроорганизмов; выбор условий должен свести к минимуму возможность завышения средней биологической нагрузки из-за подсчета одного и того же микроорганизма на разных средах;
b) при проведении мероприятий по валидации может потребоваться использование более широкого спектра питательных сред и условий инкубации в отличие от общепринятого;
c) вероятные источники микробной контаминации и типы микроорганизмов, с которыми можно столкнуться, принимая во внимание, что некоторые источники контаминации могут варьироваться в зависимости от сезона.
Медицинская продукция, изготовленная из синтетического материала, в меньшей степени подвержена контаминации облигатными анаэробами по сравнению с изготовленной из тканей или других природных материалов.
Примеры питательных сред и условий инкубации приведены в таблице A.2.
Таблица A.2
Примеры питательных сред и условий инкубации <a>
Виды микроорганизмов | Твердые среды | Жидкие среды | Условия инкубации <b> |
Факультативные неприхотливые аэробные бактерии <d> | Соево-казеиновый питательный агар (триптон-соевый агар). Питательный агар. Основа из кровяного агара. Глюкозно-триптоновый агар (питательный агар для подсчета микроорганизмов) | Соево-казеиновый питательный бульон (триптон-соевый бульон). Питательный бульон | Температура от 30 °C до 35 °C для периода от 3 до 7 дней |
Дрожжи и плесень | Декстрозовый агар Сабуро. Агар солодового экстракта. Розовый бенгальский агар. Хлорамфениколовый агар. Соево-казеиновый питательный агар (триптон-соевый агар). Агар картофельный с декстрозой. Глюкозо-триптоновый агар (питательный агар для подсчета микроорганизмов) | Декстрозовый бульон Сабуро. Бульон с экстрактом солода. Соево-казеиновый питательный бульон (триптон-соевый бульон) | Температура от 20 °C до 25 °C для периода от 5 до 7 дней |
Анаэробные бактерии | Агар для клостридий усиленный <c>. Агар Шедлера <c>. Кровяной агар <c>. Особый (прихотливый) анаэробный агар <c>. Соево-казеиновый питательный агар (триптон-соевый агар) <c>. Колумбийский агар <c>. Анаэробный агар по Вилкинсу-Чалгрену <c> | Бульон Робертсона. Бульон тиогликолевый жидкий | Температура от 30 °C до 35 °C для периода от 3 до 7 дней |
<a> Данный перечень не является исчерпывающим. <b> Перечисленные условия инкубации указывают на те условия, которые обычно используют для перечисленных типов микроорганизмов. <c> Культивируется в анаэробных условиях. Результативность может быть повышена, если предварительно уменьшить количество питательной среды. <d> Некоторые питательные среды, используемые для факультативных, не особых (неприхотливых), аэробных бактерий, способны поддерживать рост дрожжей и плесени. | |||
Следует отметить, что все неселективные методы анаэробного культивирования могут поддерживать рост факультативных анаэробных микроорганизмов.
A.6.1.5 Подсчет микроорганизмов
В лаборатории могут конкретизировать методику подсчета, которая будет достаточной в качестве рассмотрения и обоснования. См. также B.6.
A.6.2 Микробиологическая характеристика биологической нагрузки
A.6.2.1 Степень необходимой характеристики зависит от природы продукта, разнообразия обнаруженной популяции и использования данных (например, квалификация стерилизации).
A.6.2.2 Для характеристики микроорганизмов, входящих в состав биологической нагрузки на/в медицинской продукции, может быть использован широкий спектр методов.
Типичные методы микробиологической характеристики биологической нагрузки включают колонию, морфологию колоний, клеточную морфологию, окрашивающие свойства, селективное культивирование и идентификацию микроорганизмов.
Ниже приведены подробные сведения об этих методах.
a) Морфологию колоний можно четко представить, когда получено количество колоний. Описание морфологии колонии несколько субъективно и включает в себя цвет, форму, размер, текстуру, пределы, высоту и другие физически наблюдаемые характеристики колонии. Сама по себе эта информация не способствует выявлению тенденции (см. A.8). Обычно ее можно использовать для того, чтобы различать бактериальные и плесневые изоляты и первоначально определять, являются ли колонии на агаре одним и тем же микроорганизмом. Дальнейшая характеристика с целью выявления источников контаминации требует более конкретных методов.
b) Для характеристики микроорганизмов часто используют методы клеточной морфологии и окрашивания, такие как влажный мазок и окраска по Граму. Преимущества этих методов заключаются в том, что они требуют применения минимального оборудования и времени и могут дать ценную информацию об общих характеристиках микроорганизмов. Характеристика грибков (например, плесени и дрожжей) с помощью физического описания и влажного нативного мазка может быть достаточной для большинства изолятов.
c) Селективное культивирование и дифференциальные среды могут быть использованы для ингибирования роста определенных микроорганизмов, их отбора или оказания помощи в дифференциации одних микроорганизмов от других (например, цвет колонии на определенных средах), что может быть полезно для характеристики микроорганизма.
d) Идентификация микробов может быть выполнена с использованием фенотипических или генотипических методов или их комбинации. Классические фенотипические испытания, такие как морфология колоний и клеток, реакции окрашивания по Граму и окрашивание спор, способность расти аэробно или анаэробно, а также простые биохимические реакции (например, каталаза, оксидаза, индол) обычно дают определенное представление о группе или роде, к которым принадлежит бактерия. Более сложные биохимические и серологические испытания, генотипические или протеомные методы могут идентифицировать бактерии на уровне рода, вида или штамма. Аналогичный метод можно применить к дрожжам и плесени. Сочетание морфологических и физиологических свойств может быть использовано для обоснования родов, а биохимические ассимиляции - для дифференциации видов.
В таблице A.3 представлена информация об общих методах характеристики биологической нагрузки.
Таблица A.3
Признаки распространенных методов характеристики
биологической нагрузки
Метод | Пример | Специфичность |
Морфология колоний | Форма, высота, пределы, размер, цвет | Низкая |
Морфология клеток | Форма (палочка, кокки, дрожжи). Размер, агрегация (кластеры, группировка, цепочки). Анатомия (грибковые структуры) | От низкой до умеренной |
Окрашивающие свойства | Дифференциальное окрашивание (окраска по Граму, окраска спор, устойчивость к кислоте). Окраска грибов | От низкой до умеренной |
Селективное культивирование и дифференциальные среды | Тепловой шок, параметры инкубации, селективные питательные среды | От умеренной до высокой |
Идентификация рода/вида | Генетические и биохимические методы и системы идентификации | Высокая |
A.7 Валидация метода определения биологической нагрузки
A.7.1 Общие положения
В целом классические микробиологические методы представляют собой сложную задачу для пользователя при валидации по определению биологической нагрузки. Как правило, необходимость валидировать микробиологические методы или методы, описанные в национальных и международных стандартах и фармакопеях, отсутствует. Эти методы должны быть проверены только на их точность и надежность в определенных условиях использования. Таких действий обычно достаточно, чтобы подтвердить обоснованность определения биологической нагрузки.
При валидации методов испытаний биологической нагрузки необходимо учитывать два аспекта. Первый - это способность нейтрализовать ингибирующие факторы в тест-системе, чтобы позволить микроорганизмам размножаться (пригодность метода биологической нагрузки), а второй - способность удалять и культивировать микроорганизмы из продукта (эффективность восстановления биологической нагрузки).
Когда методы определения биологической нагрузки включают удаление микроорганизмов из продукта, наибольшее опасение вызывает эффективность процесса удаления. Валидация процесса удаления и культивирования называется эффективностью восстановления биологической нагрузки (подробнее см. приложение C).
A.7.2 Валидация
A.7.2.1 Целесообразность метода биологической нагрузки
Проверку пригодности метода биологической нагрузки используют для демонстрации того, что продукт не препятствует росту или обнаружению микроорганизмов. Продукт может содержать вещества, ингибирующие микроорганизмы в условиях испытания биологической нагрузки.
При испытании продукта, содержащего антимикробные вещества, следует использовать разведение или подходящие методы инактивации/нейтрализации.
Ингибирующее действие веществ, элюированных из продукта, должно быть исследовано на стадии предварительных экспериментов, чтобы оценить, содержит ли продукт вещества, которые могут вызывать ингибирование роста микроорганизмов в условиях испытания на биологическую нагрузку. Документальное обоснование может быть приемлемым, если изделие содержит материалы, которые уже известны или были продемонстрированы как инертные.
Следует рассмотреть вопрос о пригодности метода биологической нагрузки:
a) когда появляются новые или модифицированные продукты, а также
b) каждый раз, когда происходит изменение условий проведения испытания (например, условия инкубации, экстракционные среды).
Применение методов к продуктам с заданной пригодностью для микробоцидных или микробостатических веществ (например, мембранная фильтрация с валидированной процедурой промывки мембран) не требует проверки пригодности конкретного продукта методом биологической нагрузки.
A.7.2.2 Эффективность восстановления биологической нагрузки
Существует два основных подхода, доступных для проверки эффективности удаления микроорганизма из медицинских продуктов (см. C.1.4):
- повторяющееся восстановление: повторная обработка образца продукта с последующей количественной оценкой степени восстановления;
- инокуляция продукта: продукт инокулируют заданными уровнями микроорганизмов с последующей количественной оценкой степени восстановления.
Первый из этих подходов имеет преимущество при использовании естественных микроорганизмов, но требует умеренной или высокой начальной биологической нагрузки. Если это так, то первый подход может быть предпочтительным в зависимости от продукта и/или конфигурации. Второй подход создает модельную систему для целей испытания, но при этом возникают вопросы применимости к восстановлению естественных микроорганизмов. Дополнительная информация приведена в таблице C.1.
Менее традиционные продукты (например, комплексные или сложные продукты, содержащие порошки, жидкости, антимикробные агенты, многочисленные компоненты) могут потребовать сочетания подходов оценки эффективности восстановления биологической нагрузки. Дополнительная информация приведена в приложении C.
Для жидких продуктов, которые подвержены фильтрованию, или при использовании метода НВЧ определение эффективности восстановления биологической нагрузки и расчет корректирующего коэффициента биологической нагрузки не являются необходимыми. Однако пригодность метода испытаний для подсчета должна быть оценена.
A.7.2.3 Подсчет и условия культивирования
Дополнительные указания по подсчету приведены в разделе B.6.
Условия культивирования (т.е. среды и условия инкубации), выбранные для использования при определении биологической нагрузки, не могут быть рассчитаны на обнаружение всех потенциальных микроорганизмов. Поэтому на практике вполне вероятно, что биологическая нагрузка будет недооценена. Тем не менее решение о соответствующих условиях культивирования должно быть принято.
Один из методов оценки условий культивирования состоит в выборе условий культивирования на основе знаний о производственном процессе, окружающей среде, материалах и микроорганизмах, которые, как ожидается, будут присутствовать. Если согласно конкретным характеристикам продукта необходима дополнительная оценка, то микроорганизмы, подсчитанные в типичных условиях культивирования, сравнивают с микроорганизмами, обнаруженными в альтернативных условиях культивирования. Если этот метод указывает на то, что низкая доля биологической нагрузки обнаруживается в типичных условиях культивирования, то альтернативные условия культивирования должны быть пересмотрены для оптимизации определения, что особенно важно для тех медицинских продуктов, в которых антимикробные препараты могут влиять на рост микробов.
При выборе методов для использования в микробиологической характеристике микроорганизмов необходимо учитывать следующее:
- риск для производимого продукта с учетом метода квалификации стерилизации;
- ранее доступные данные;
- цель генерации данных;
- характер производственного процесса (например, использованная вода, ручное управление, автоматизация) и продукта.
A.8 Рутинное определение биологической нагрузки и интерпретация данных
A.8.1 Общие положения
Для демонстрации того, что эффективный контроль микробиологического качества внедрен и поддерживается, следует разработать программу мониторинга продукта и/или компонентов.
Общепринятой практикой является использование выборки размером от трех до десяти единиц для рутинного мониторинга биологической нагрузки.
В тех случаях, когда данные биологической нагрузки используют для удовлетворения требований другого стандарта (например, стандартов серии ИСО 11137), размер выборки и частота испытаний могут быть предопределены в соответствии с этим стандартом, согласно которому будет заменен рекомендуемый размер выборки.
Рациональный выбор размера выборки в первую очередь зависит от двух факторов.
a) Изменение биологической нагрузки должно быть обнаружено.
Это будет зависеть от последствий, связанных с изменением (увеличением или уменьшением) биологической нагрузки, и от того, как применяется информация о биологической нагрузке. Для раннего выявления небольшого изменения средней биологической нагрузки может потребоваться большой размер выборки.
b) Вариация оценок количества жизнеспособных микроорганизмов, присутствующих на отдельных образцах.
Степень этой изменчивости будет определять размер выборки, необходимый для обнаружения данного изменения. Небольшие вариации между позициями в таких оценках потребуют меньшего размера выборки для обнаружения изменений, чем это нужно для больших вариаций между позициями.
Большие размеры выборки могут способствовать обнаружению значительных изменений.
Следует признать, что способ использования данных биологической нагрузки может влиять на уровень достоверности обнаружения изменения заданной величины. Необходимо сделать рациональный выбор величины обнаруживаемого изменения и вероятности достижения этого обнаружения.
Рациональный выбор частоты мониторинга должен быть сделан с учетом различных факторов, включающих следующие:
- наличие предыдущих данных;
- цель генерации данных;
- характер производственного процесса;
- частота производства продукта;
- критичность своевременного обнаружения изменений биологической нагрузки;
- сезонные и экологические изменения.
Отбор проб может быть осуществлен с периодичностью, основанной на времени (например, ежемесячно, ежеквартально) или на объеме производства (например, альтернативные партии). Однако для того, чтобы установить исходные уровни, общепринятой практикой является определение биологической нагрузки с высокой частотой в начале производства нового продукта и со снижением этой частоты по мере получения информации о биологической нагрузке в процессе производства.
Частота определения биологической нагрузки должна обнаруживать изменения в биологической нагрузке, например: вызванные сезонными колебаниями, производственными изменениями или изменениями в материалах.
A.8.2 Пределы обнаружения и подсчет на агаре
A.8.2.1 Пределы обнаружения
Пределы обнаружения (LOD) для методов испытания биологической нагрузки следует принимать во внимание при определении значения биологической нагрузки. Для микробиологической отчетности, когда часть экстракта исследуют на биологическую нагрузку и извлекают нулевые колонии, результаты обычно регистрируют как менее чем "X", где "1/X" является репрезентативным для фракции исследуемой части. Например, если изделие экстрагируется в 400 мл и 1/4 экстракта фильтруется, результаты нулевых колоний будут регистрироваться как менее 4 колониеобразующих единиц (т.е. < 4 КОЕ). Таким образом, LOD для этого примера равен 4. В микробиологической отчетности результат < 4 КОЕ означает, что, возможно, весь экстракт содержит либо 0, 1, 2 или 3 КОЕ, но правила микробиологической отчетности требуют, чтобы он был представлен как < 4 КОЕ.
Индивидуальные результаты биологической нагрузки представлены целыми числами, потому что это число является репрезентативным для колониеобразующей единицы. Средние значения или другие математические вычисления с использованием данных биологической нагрузки обычно приводят с точностью до одного десятичного знака.
LOD может быть усовершенствован следующим образом:
a) изменение метода испытания (например, фильтрация большей части экстракта);
b) объединение нескольких образцов;
c) использование другого метода тестирования, такого как НВЧ.
A.8.2.2 Подсчет на агаре
В стандартных микробиологических методах для других промышленных применений рекомендуется выбирать чашки с агаром, содержащие приемлемые диапазоны (например, менее 200 КОЕ, от 25 до 250 КОЕ или от 30 до 300 КОЕ). Это применимо, когда выполняется несколько разбавлений, из которых можно выбрать. Однако при испытании биологической нагрузки это не всегда так, потому что:
- многие продукты имеют низкую биологическую нагрузку, которая будет иметь количество на пластине менее чем, например, 30 КОЕ;
- многократные разбавления не всегда необходимы, когда количество невелико.
Для этих ситуаций целесообразно регистрировать и использовать количество менее 30 КОЕ. Подсчет на агаре можно проводить тремя различными способами:
a) прямой подсчет КОЕ;
b) приблизительное количество;
c) отсчеты, выходящие за пределы счетных или расчетных диапазонов.
Посредством прямого подсчета в таблицу сводят все колонии непосредственно с помощью любого метода, который облегчает точные подсчеты (электронный счетчик, маркировочные таблички и т.д.).
Предполагаемый подсчет может быть выполнен, когда колонии на части агара могут быть подсчитаны и умножены на оставшиеся части агара.
Приблизительный подсчет - это один из способов получения подсчета при наличии распространяющихся колоний. Этот метод обычно применяют, когда распространяющиеся колонии не вытесняют другие колонии (из-за размера или непрозрачности).
Подсчеты, выходящие за пределы счетного или расчетного диапазона, могут быть полуколичественными, если это значение может быть округлено на основе наличия различимых колоний. Однако, если это невозможно сделать, следует установить результат предельно большого количества подсчетов (TNTC). Приемлемой практикой является исключение результатов TNTC из среднего значения для группы выборок. Результаты TNTC должны быть исследованы.
Когда используют дубликаты чашек с агаром, коэффициенты разбавления или аликвоты, количество чашек с агаром должно быть соответствующим образом скорректировано, чтобы получить количество для одного продукта.
A.8.3 Микробиологическая характеристика
Если при микробиологической характеристике выделяют типы микроорганизмов, не входящие в состав нормальной биологической нагрузки, следует рассмотреть вопрос об оценке значимости присутствия этих изолятов.
A.8.4 Данные биологической нагрузки для определения степени обработки
Дополнительные указания отсутствуют.
A.8.5 Пики биологической нагрузки
Данные биологической нагрузки могут демонстрировать значение, которое существенно больше (обычно называемые пики биологической нагрузки), чем другие значения в ряде полученных. Этот пик биологической нагрузки может произойти в одной из двух следующих ситуаций:
a) это значение не является нормальной и последовательной частью распределения биологической нагрузки;
b) то значение может быть нормальной и последовательной частью распределения биологической нагрузки.
Можно определить, что скачок (пик) биологической нагрузки не является нормальной и последовательной частью распределения биологической нагрузки, изучив производственную практику, микробиологические испытания и обработку образцов. В данном разделе установлено, как определить и как действовать в данной ситуации.
Анализируя предыдущие данные, можно определить, что скачок (пик) биологической нагрузки является нормальной и последовательной частью распределения биологической нагрузки. Предыдущие данные могут демонстрировать периодическое появление большей величины, которая находится в пределах ожиданий, что делает ее последовательной частью биологической нагрузки. Если эти данные состоят из микроорганизмов, обычно встречающихся на продукте, это делает его нормальной частью биологической нагрузки. Эти увеличения следует учитывать при определении степени обработки процесса стерилизации. Например, увеличение биологической нагрузки может произойти из-за несоответствия сырья или производственных процессов, связанных с чрезмерной обработкой.
В примере, приведенном в таблице A.4, есть 3 партии (партии 2, 5, 6) в 10 партиях, которые содержат индивидуальные значения, существенно превышающие среднее значение партии (в данном примере в пять и более раз среднее значение партии). Установлено, что эти высокие значения являются нормальной и последовательной частью биологической нагрузки. Следовательно, высокие значения и/или средние значения партии для тех партий, которые содержат высокие значения, могут быть приняты во внимание при определении общей средней биологической нагрузки для определения степени обработки в процессе стерилизации.
Таблица A.4
Пример данных по биологической нагрузке, включающих пик
биологической нагрузки
Номер партии | Номер образца | Среднее значение (КОЕ/изделие) | |||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | ||
1 | 4 | 20 | 12 | 12 | 4 | 32 | 28 | 4 | 4 | 8 | 12,8 |
2 | 12 | 32 | 20 | 458 | 88 | 120 | 40 | 44 | 36 | 60 | 91,0 |
3 | 36 | 44 | 52 | 88 | 36 | 48 | 344 | 96 | 180 | 128 | 105,2 |
4 | 30 | 4 | 8 | 4 | 12 | 24 | 24 | 20 | 28 | 4 | 15,8 |
5 | 36 | 52 | 48 | 36 | 920 | 4 | 36 | 72 | 4 | 36 | 124,4 |
6 | 36 | 32 | 12 | 36 | 36 | 36 | 386 | 72 | 88 | 36 | 77,0 |
7 | 40 | 20 | 52 | 44 | 36 | 4 | 36 | 44 | 52 | 308 | 63,6 |
8 | 24 | 20 | 12 | 16 | 4 | 24 | 36 | 80 | 24 | 8 | 24,8 |
9 | 8 | 40 | 20 | 48 | 12 | 8 | 4 | 20 | 28 | 44 | 23,2 |
10 | 40 | 104 | 8 | 16 | 28 | 24 | 44 | 8 | 4 | 8 | 28,4 |
| 56,6 | ||||||||||
A.8.6 Уровни биологической нагрузки
При превышении указанных уровней должен быть принят заранее определенный порядок действий. Если корректирующие действия приводят к изменениям в процессе, влияющим на биологическую нагрузку, следует получить новые данные и установить новые уровни для данного продукта.
Указанные уровни, используемые для биологической нагрузки, обычно основаны на предыдущих данных для продукта и реализации цели, для которой эти данные должны быть использованы. До сбора предыдущих данных, если требуются временные уровни, они могут быть установлены после оценки первых трех или более партий этого продукта. Предыдущие данные по аналогичным продуктам, производственным процессам и/или производственным средам также могут быть использованы при установлении временных уровней для новых производственных линий. Для некоторых продуктов можно ожидать значительных сезонных колебаний биологической нагрузки. Сезонные изменения влажности и/или температуры также могут изменить типы и количество микроорганизмов в биологической нагрузке. Основываясь на последовательных результатах испытаний, данные биологической нагрузки должны быть повторно оценены через определенный период времени, чтобы проверить, сохраняется ли соответствие биологической нагрузки исходным уровням.
Предыдущие данные биологической нагрузки используют для установления уровней биологической нагрузки, которые обычно определяют как уровни оповещения и уровни действий. При установлении этих уровней следует учитывать используемый метод, основанный на предполагаемом применении поступающей информации. Например, уровни могут быть использованы для оценки поставщиков сырья, квалификации или демонстрации постоянной эффективности процесса стерилизации или для оценки эффективности экологического контроля в производственном процессе.
Наряду с установлением уровней следует рассмотреть вопрос о принятии мер в том случае, если этот уровень будет превышен. Эти действия должны быть основаны на том, что биологическая нагрузка состоит из живых микроорганизмов и испытание биологической нагрузки определяет биологическую нагрузку продукта, который расположен в изделии и/или на нем различными способами. Не ожидается, что биологические данные о микроорганизмах будут точными, но, скорее всего, в них присутствует значительный диапазон. Также не требуется, чтобы данные о биологической нагрузке соответствовали какому-либо статистическому распределению.
Одним из распространенных методов определения уровней готовности и воздействия биологической нагрузки является использование стандартных погрешностей. В этом случае расчет стандартной погрешности применяют для распределения данных, при этом соответствие данных биологической нагрузке определенному статистическому распределению не является приоритетным.
Данные, идентифицированные как нестандартно высокие или низкие или как нетипичные тенденции, должны быть исследованы. Нетипичные данные, имеющие определенную причину (например, лабораторная ошибка, случайные высокие значения, обнаруженные в производственном процессе), могут быть исключены из расчетов при установлении уровней для мониторинга биологической нагрузки. Когда данные по биологической нагрузке анализируют для использования в решении, связанном с качеством, в анализ включают индивидуальные результаты тестирования, такие как "отсутствие увеличения" или "чрезмерно большое количество для подсчета" (TNTC).
A.8.7 Анализ данных
Графическое представление данных, собранных в течение определенного времени, может быть целесообразным для разграничения фактических тенденций от изменчивости выборки, а также представление данных может указывать на то, что произошло значительное изменение микробиологической популяции, даже если значения биологической нагрузки находятся в пределах заданных уровней.
Прежде чем проводить статистические вычисления по данным, полученным на основе определений биологической нагрузки, особенно при фиксировании большого количества наблюдений, может возникнуть необходимость в управлении данными таким образом, чтобы выявить существенные особенности. Это можно сделать качественным образом, объединив измерения для формирования частотных таблиц и диаграмм. После завершения работы данные могут быть изучены на предмет предполагаемых тенденций.
Существует целый ряд методов определения тенденции, которые могут быть применены к биологической нагрузке. Эти тенденционные методы могут быть, но не ограничиваются ими, тенденционными средними значениями биологической нагрузки или оценками биологической нагрузки, контрольными картами Шухарта по ИСО 7870-2, контролем на основе диапазона (BOR) или CUSUM-тестами по ИСО 7870-4. Каждый из этих различных методов может быть использован для установления возможного отклонения от стандартного случайного разброса результатов и выделения отклонений.
В некоторых случаях может оказаться целесообразным использование более одного из этих методов для определения того, следует ли предпринимать какие-либо действия на основе имеющегося набора данных или требуются дополнительные данные.
A.8.8 Статистические методы
В ИСО 13485 приведены требования к планированию соответствующих методов измерения и анализа, включая выбор подходящих статистических методов. Изучение данных, полученных в результате определения биологической нагрузки для широкого спектра продукта, иллюстрирует изменчивость таких данных. Значения биологической нагрузки из группы будут варьироваться в пределах группы предметов, и, следовательно, при анализе данных обычно используют соответствующие средства. Очевидно, что эти средние значения могут принимать высокие, промежуточные или низкие значения, а средние значения будут меняться с течением времени. Кроме того, типы микроорганизмов, входящих в состав биологической нагрузки, также могут варьироваться.
Как правило, наблюдаемая характеристика частотных распределений данных, полученных из определений биологической нагрузки, заключается в том, что распределения являются искаженными и могут демонстрировать значение остатка. Для низких или промежуточных данных модальное значение равно нулю. В этих условиях биологическая нагрузка, как правило, низкая, но иногда могут быть и высокие значения, даже несмотря на эффективное применение контрольных мер.
A.9 Содержание метода определения биологической нагрузки
A.9.1 Изменения в продукте и/или производственном процессе
Изменения в продукте и/или производственном процессе также должны быть пересмотрены на предмет возможного влияния на эффективность метода определения этого уровня. Результаты проверки должны быть зафиксированы (см. 4.1.2). В некоторых случаях может возникнуть необходимость в изменении и/или переквалификации метода определения биологической нагрузки.
A.9.2 Изменения в методике определения биологической нагрузки
В настоящем стандарте требования не приведены.
A.9.3 Переаттестация метода определения биологической нагрузки
В настоящем стандарте требования не приведены.
Подписаться на обновления