ГОСТ 32031-2022. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые. Методы выявления бактерий Listeria monocytogenes и других видов Listeria (Listeria spp.)
Приложение Б
(обязательное)
СОСТАВ И ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И РЕАКТИВОВ
Б.1 Селективные среды первичного обогащения
Б.1.1 Полуконцентрированный бульон Фразера (Half Fraser broth)
Б.1.1.1 Основа среды
Состав:
мясной пептон (пептический перевар животной ткани) . . . . . . | 5,0 г |
триптон (ферментативный гидролизат казеина) . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
мясной экстракт . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
дрожжевой экстракт . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
хлорид натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 20,0 г |
натрий фосфорнокислый двузамещенный . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 12,0 г |
калий фосфорнокислый однозамещенный . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1,35 г |
эскулин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1,0 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1000 см3 |
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, нагревая при необходимости.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,2 +/- 0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема в количестве, необходимом для проведения анализа (см. Б.10.1), и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Примечание - Раствор хлорида лития и раствор налидиксовой кислоты могут быть добавлены в основу до стерилизации.
Б.1.1.2 Растворы селективных добавок
Б.1.1.2.1 Раствор хлорида лития
Состав:
хлорид лития . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 3,0 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10,0 см3 |
Приготовление
Хлорид лития растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют раствор путем фильтрования.
Предупреждение - Необходимо принимать все меры предосторожности при растворении хлорида лития в воде, так как реакция является экзотермической. Раствор хлорида лития раздражает слизистую оболочку.
Б.1.1.2.2 Раствор натриевой соли налидиксовой кислоты
Состав:
натриевая соль налидиксовой кислоты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,1 г |
0,05 моль/дм3 раствора гидроксида натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10,0 см3 |
Приготовление
Натриевую соль налидиксовой кислоты растворяют в растворе гидроксида натрия и стерилизуют раствор путем фильтрования.
Б.1.1.2.3 Раствор акрифлавина гидрохлорида
Состав:
акрифлавин гидрохлорид . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,25 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 100 см3 |
Приготовление
Акрифлавин гидрохлорид растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют раствор путем фильтрования.
Б.1.1.2.4 Раствор цитрата аммонийного железа (III)
Состав:
цитрат аммонийного железа (III) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 100 см3 |
Приготовление
Цитрат аммонийного железа (III) растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют раствор путем фильтрования.
Б.1.1.3 Готовая среда
Состав:
основа среды (см. Б.1.1.1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 100 см3 |
раствор хлорида лития (см. Б.1.1.2.1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1,0 см3 |
раствор натриевой соли налидиксовой кислоты (см. Б.1.1.2.2) . . | 0,1 см3 |
раствор акрифлавина гидрохлорида (см. Б.1.1.2.3) . . . . . . . . . . . . | 0,5 см3 |
раствор цитрата аммонийного железа (III) (см. Б.1.1.2.4) . . . . . . . | 1,0 см3 |
Приготовление
В основу среды добавляют четыре раствора селективных добавок непосредственно перед использованием.
Б.1.2 Селективный накопительный бульон (UVM)
Состав:
триптоза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10,0 г |
мясной экстракт . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
дрожжевой экстракт . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
хлористый натрий . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 20,0 г |
фосфорнокислый натрий двузамещенный . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 12,0 г |
калий фосфорнокислый однозамещенный . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1,35 г |
эскулин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1,0 г |
налидиксовая кислота . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 20,0 мг |
акрифлавин гидрохлорид . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 12,0 мг |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1000,0 см3 |
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, нагревая при необходимости.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,2 +/- 0,2) ед. pH. Разливают среду в колбы или во флаконы соответствующего объема в количестве 225 см3 и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.1.3 Питательный бульон для выделения и культивирования листерий (ПБЛ I)
Б.1.3.1 Основа среды
Состав:
гидролизат казеина ферментативный . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10,0 г |
пептон мясной ферментативный . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 15,0 г |
гидролизат дрожжей автолизованных . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 2,0 г |
хлорид натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 3,5 г |
хлорид лития . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 3,0 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1000,0 см3 |
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, нагревая при необходимости.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,0 +/- 0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Разливают среду в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.1.3.2 Раствор селективной добавки
Состав:
налидиксовая кислота . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10 мг |
акрифлавин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5 мг |
полимиксин B сульфат . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5 мг |
стерильная дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10 см3 |
Приготовление
Налидиксовую кислоту, акрифлавин и полимиксин B сульфат растворяют в стерильной дистиллированной воде.
Б.1.3.3 Готовая среда
Состав:
основа среды (см. Б.1.3.1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1000 см3 |
раствор селективной добавки (см. Б.1.3.2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 4,44 см3 |
Приготовление
В основу среды добавляют раствор селективной добавки. Среду хранят не более двух суток в защищенном от света месте при температуре не выше 8 °C.
Б.2 Селективные среды вторичного обогащения
Б.2.1 Бульон Фразера (Fraser broth)
Б.2.1.1 Основа среды
Состав:
мясной пептон (пептический перевар животной ткани) . . . . . . | 5,0 г |
триптон (ферментативный гидролизат казеина) . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
мясной экстракт . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
дрожжевой экстракт . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
хлорид натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 20,0 г |
натрий фосфорнокислый двузамещенный . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 12,0 г |
калий фосфорнокислый однозамещенный . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1,35 г |
эскулин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1,0 г |
хлорид лития . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 3,0 г |
натриевая соль налидиксовой кислоты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,1 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1000 см3 |
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, нагревая ее при необходимости.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,2 +/- 0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема в количестве необходимом для проведения анализа и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.2.1.2 Растворы селективных добавок
Б.2.1.2.1 Раствор акрифлавина гидрохлорида - по Б.1.1.2.3.
Б.2.1.2.2 Раствор цитрата аммонийного железа (III) - по Б.1.1.2.4.
Б.2.1.3 Готовая среда
Приготовление
В пробирки с 10 см3 основы среды (см. Б.2.1.1) добавляют по 0,1 см3 раствора акрифлавина гидрохлорида (см. Б.2.1.2.1) и раствор цитрата аммонийного железа (III) (см. Б.2.1.2.2) непосредственно перед использованием.
Б.2.2 Селективный накопительный бульон (UVM II)
Б.2.2.1 Основа среды
Согласно Б.1.2.
Б.2.2.2 Раствор акрифлавина гидрохлорида
Состав:
акрифлавин гидрохлорид . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 13 мг |
стерильная дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10 см3 |
Приготовление
Акрифлавин гидрохлорид растворяют в стерильной дистиллированной воде.
Б.2.2.3 Готовая среда
Состав:
основа среды (см. Б.2.2.1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1000 см3 |
раствор акрифлавина гидрохлорида (см. Б.2.2.2) . . . . . . . . . . . . | 4,44 см3 |
Приготовление
К 1000,0 см3 основы среды (см. Б.2.2.1) добавляют раствор акрифлавина гидрохлорида (см. Б.2.2.2).
Б.2.3 Питательный бульон для выделения и культивирования листерий (ПБЛ II)
Б.2.3.1 Основа среды
Согласно Б.1.3.
Б.2.3.2 Раствор селективной добавки
Состав:
налидиксовая кислота . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10 мг |
акрифлавин гидрохлорид . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5 мг |
полимиксин B сульфат . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5 мг |
стерильная дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5 см3 |
Приготовление
Налидиксовую кислоту, акрифлавин гидрохлорид и полимиксин B сульфат растворяют в стерильной дистиллированной воде.
Б.2.3.3 Готовая среда
Состав:
основа среды (см. Б.2.3.1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1000 см3 |
раствор селективной добавки (см. Б.2.3.2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 4,44 см3 |
Приготовление
В основу среды (см. Б.2.3.1) добавляют раствор селективной добавки (см. Б.2.3.2) и разливают в стерильные пробирки по 10 см3. Среду хранят не более двух суток в защищенном от света месте при температуре не выше 8 °C.
Б.2.4 Бульон для обогащения Listeria monocytogenes (LMX Broth)
Б.2.4.1 Основа среды
Состав:
ферментативный перевар животных тканей (бычьих/свиных) . | 5 г |
ферментативный перевар казеина (бычий) . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5 г |
мясной экстракт (бычий/свиной) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5 г |
дрожжевой экстракт . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5 г |
буфер . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 18,32 г |
смесь солей . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 11 г |
глюкоза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 2 г |
акрифлавин гидрохлорид . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,005 г |
налидиксовая кислота . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,01 г |
очищенная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1000 см3 |
Б.2.4.2 Раствор селективной добавки
Состав:
цефалексин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | >= 1% |
фосфомицин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | >= 1% |
смесь антибиотиков/противогрибковых препаратов . . . . . . . . . | > 2% |
Б.3 Селективные плотные среды для пересева
Б.3.1 Первая среда
Б.3.1.1 Агар Listeria по Оттавиани и Агости (ALOA)
Б.3.1.1.1 Основа среды
Состав:
ферментативный перевар животного белка . . . . . . . . . . . . . . . . . | 18,0 г |
панкреатический гидролизат казеина . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 6,0 г |
дрожжевой экстракт . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10,0 г |
пируват натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 2,0 г |
глюкоза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 2,0 г |
глицерофосфат магния . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1,0 г |
сульфат магния (безводный) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,5 г |
хлорид натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
хлорид лития . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10,0 г |
натрий фосфорнокислый двузамещенный (безводный) . . . . . . . | 2,5 г |
| 0,05 г |
агар . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 12,0 - 18,0 г <*> |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 930 см3 <**> |
. . . .
--------------------------------
<*> В зависимости от плотности среды.
<**> 925 см3, если используют раствор амфотерицина B.
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют при нагревании в дистиллированной воде.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,2 +/- 0,2) ед. pH. Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.3.1.1.2 Растворы селективных добавок
Б.3.1.1.2.1 Раствор налидиксовой кислоты
Состав:
натриевая соль налидиксовой кислоты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,02 г |
0,05 моль/дм3 раствора гидроксида натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 см3 |
Приготовление
Натриевую соль налидиксовой кислоты растворяют в 5 см3 0,05 моль/дм3 раствора гидроксида натрия и стерилизуют раствор путем фильтрования.
Б.3.1.1.2.2 Раствор цефтазидима
Состав:
цефтазидим . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,02 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 см3 |
Приготовление
Цефтазидим растворяют в 5 см3 дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.
Б.3.1.1.2.3 Раствор полимиксина B сульфата
Состав:
полимиксин B сульфат . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 76700,0 е.а. |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 см3 |
Приготовление
Полимиксин B сульфат растворяют в 5 см3 дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.
Б.3.1.1.3 Растворы антибиотиков
Б.3.1.1.3.1 Раствор циклогексимида
Состав:
циклогексимид . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,05 г |
этанол . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 2,5 см3 |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 2,5 см3 |
Приготовление
Циклогексимид растворяют в 2,5 см3 этанола, затем добавляют 2,5 см3 дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.
Б.3.1.1.3.2 Раствор амфотерицина B (используется как альтернатива для раствора циклогексимида)
Состав:
амфотерицин B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,01 г |
1 моль/дм3 раствора соляной кислоты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 2,5 см3 |
диметилформамид (DMF) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 7,5 см3 |
Приготовление
Амфотерицин растворяют в растворе соляной кислоты и диметилформамида (DMF) и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.
Предупреждение - Раствор соляной кислоты и диметилформамид (DMF) очень токсичны. Обращаться с осторожностью.
Б.3.1.1.4 Дифференциальная добавка
Состав:
| 2,0 г |
холодная дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 50 см3 |
--------------------------------
<*> Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.
Приготовление
(Sigma P 
) растворяют в холодной дистиллированной воде. Раствор перемешивают в течение 30 мин до получения гомогенной суспензии. Автоклавируют при температуре 121 °C в течение 15 мин с последующим охлаждением до температуры (47 +/- 2) °C.
Б.3.1.1.5 Готовая среда
Состав:
основа среды (см. Б.3.1.1.1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 930,0 см3 <*> |
раствор налидиксовой кислоты (см. Б.3.1.1.2.1) . . . . . . . . . . . . . | 5,0 см3 |
раствор цефтазидима (см. Б.3.1.1.2.2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 см3 |
раствор полимиксина B сульфата (см. Б.3.1.1.2.3) . . . . . . . . . . . . | 5,0 см3 |
раствор циклогексимида (см. Б.3.1.1.3.1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 см3 |
или амфотерицина B (см. Б.3.1.1.3.2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10,0 см3 |
дифференциальная добавка (см. Б.3.1.1.4) . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 50,0 см3 |
--------------------------------
<*> 925 см3, если используют раствор амфотерицина B.
Приготовление
В расплавленную и охлажденную на водяной бане до температуры (47 +/- 2) °C основу среды (см. Б.3.1.1.1) добавляют растворы ингибиторов (см. Б.3.1.1.2.1, Б.3.1.1.2.2, Б.3.1.1.2.3), антибиотиков (см. Б.3.1.1.3.1, Б.3.1.1.3.2) и дифференциальную добавку (см. Б.3.1.1.4), тщательно перемешивая после каждого добавления.
pH готовой среды должен составлять (7,2 +/- 0,2) ед. pH.
Готовая среда должна быть гомогенной и непрозрачной.
В стерильные чашки Петри разливают свежеприготовленную готовую среду приблизительно по 15 - 20 см3 и дают агару затвердеть.
Непосредственно перед применением среда в чашках должна быть подсушена в соответствии с ГОСТ ISO 11133.
Б.3.1.2 Оценка качества первой среды
Определение селективности и продуктивности питательной среды необходимо проводить согласно ГОСТ ISO 11133.
Б.3.2 Вторая селективная среда для посева
Б.3.2.1 Оксфорд агар (Oxford agar)
Б.3.2.1.1 Основа среды
Состав:
пептон . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 23,0 г |
крахмал . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1,0 г |
хлорид натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
эскулин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1,0 г |
цитрат аммонийного железа (III) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,5 г |
хлорид лития . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 15,0 г |
агар . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 9,0 - 18,0 г <**> |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1000,0 см3 |
--------------------------------
<**> В зависимости от плотности среды
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде при нагревании.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,0 +/- 0,2) ед. pH. Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.3.2.1.2 Раствор селективной добавки
Состав:
циклогексимид . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 400,0 мг |
сульфат колистина (полимиксин E) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 20,0 мг |
акрифлавин гидрохлорид . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 мг |
цефотетан . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 2,0 мг |
фосфомицин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10,0 мг |
этанол . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 см3 |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 см3 |
Приготовление
Компоненты добавки растворяют в смеси этанола и воды. Стерилизуют раствор фильтрованием.
Б.3.2.1.3 Готовая среда
Приготовление
В расплавленную и охлажденную на водяной бане до температуры (47 +/- 2) °C основу среды (см. Б.3.2.1.1) добавляют, тщательно перемешивая, раствор селективной добавки (см. Б.3.2.1.2).
В стерильные чашки Петри разливают свежеприготовленную готовую среду приблизительно по 15 - 20 см3 и дают агару затвердеть.
Непосредственно перед применением среда в чашках должна быть подсушена в соответствии с ГОСТ ISO 11133.
Б.3.2.2 Палкам агар (PALCAM agar)
Б.3.2.2.1 Основа среды
Состав:
пептон . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 23,0 г |
крахмал . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1,0 г |
хлорид натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
дрожжевой экстракт . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 3,0 г |
D-глюкоза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,5 г |
D-маннит . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10,0 г |
эскулин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,8 г |
цитрат аммонийного железа (III) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,5 г |
феноловый красный . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,08 г |
хлорид лития . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 15,0 г |
агар . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 9,0 - 18,0 г <*> |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 960,0 см3 |
--------------------------------
<*> В зависимости от плотности среды.
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде при нагревании.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,2 +/- 0,2) ед. pH. Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.3.2.2.2 Раствор полимиксина B сульфата
Состав:
полимиксин B сульфат (100000 е.а.) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,1 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 100 см3 |
Приготовление
Растворяют полимиксин B сульфат в воде. Стерилизуют раствор фильтрованием.
Б.3.2.2.3 Раствор акрифлавина гидрохлорида
Состав:
акрифлавин гидрохлорид . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,05 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 100 см3 |
Приготовление
Растворяют акрифлавин гидрохлорид в дистиллированной воде. Стерилизуют раствор фильтрованием.
Б.3.2.2.4 Раствор пентагидрата цефтазидима натрия
Состав:
пентагидрат цефтазидима натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,116 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 100 см3 |
Приготовление
Растворяют пентагидрат цефтазидима натрия в воде. Стерилизуют раствор фильтрованием.
Б.3.2.2.5 Готовая среда
Состав:
основа агара . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 960,0 см3 |
раствор полимиксин B сульфата . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10,0 см3 |
раствор акрифлавина гидрохлорида . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10,0 см3 |
раствор пентагидрата цефтазидима натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . | 20,0 см3 |
Приготовление
В расплавленную и охлажденную на водяной бане до (47 +/- 2) °C основу среды (см. Б.3.2.2.1), добавляют, тщательно перемешивая, растворы добавок (см. Б.3.2.2.2, Б.3.2.2.3).
В стерильные чашки Петри разливают свежеприготовленную готовую среду приблизительно по 15 - 20 см3 и дают агару затвердеть.
Непосредственно перед применением среда в чашках должна быть подсушена в соответствии с ГОСТ ISO 11133.
Б.3.2.3 Питательный агар для выделения листерий (ПАЛ)
Б.3.2.3.1 Основа среды
Состав:
гидролизат казеина панкреатический . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10,0 г |
гидролизат рыбной муки панкреатический . . . . . . . . . . . . . . . . . | 15,0 г |
гидролизат автолизованных дрожжей . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 2,0 г |
хлорид натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 3,5 г |
хлорид лития . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 15,0 г |
цитрат аммонийного железа . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,5 г |
эскулин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,8 г |
агар . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 13,0 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | до 1000,0 см3 |
Приготовление
Компоненты растворяют в дистиллированной воде при нагревании и тщательно перемешивают до полного растворения. Устанавливают pH (7,0 +/- 0,2) ед. pH и стерилизуют в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Б.3.2.3.2 Раствор селективной добавки
Состав:
налидиксовая кислота . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 20 мг |
акрифлавин гидрохлорид . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10 мг |
полимиксин B сульфат . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10 мг |
стерильная дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10 см3 |
Приготовление
Налидиксовую кислоту, акрифлавин и полимиксин B сульфат растворяют в стерильном физиологическом растворе.
Б.3.2.3.3 Готовая среда
Состав:
основа среды (см. Б.3.2.3.1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1000 см3 |
раствор селективной добавки (см. Б.3.2.3.2) . . . . . . . . . . . . . . . . | 4,44 см3 |
Приготовление
К расплавленной основе среды добавляют с соблюдением правил асептики раствор селективной добавки. Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри и хранят не более двух суток в защищенном от света месте при температуре не выше 8 °C.
Б.3.2.4 Бриллианс Listeria агар (BRILLIANCE LISTERIA agar)
Б.3.2.4.1 Основа среды
Состав:
пептон . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 18,5 г |
дрожжевой экстракт . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 4,0 г |
хлорид натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 9,5 г |
пируват натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 2,0 г |
хлорид лития . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 15,0 г |
мальтоза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 4,0 г |
| 0,2 г |
агар . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 14,0 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 930 см3 <*> |
--------------------------------
<*> 925 см3, если используют раствор амфотерицина B.
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют при нагревании в дистиллированной воде.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,2 +/- 0,2) ед. pH. Разливают основу среды в колбы или флаконы соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.3.2.4.2 Растворы селективных добавок
Б.3.2.4.2.1 Раствор налидиксовой кислоты
Состав:
натриевая соль налидиксовой кислоты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,02 г |
0,05 моль/дм3 раствора гидроксида натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 см3 |
Приготовление
Натриевую соль налидиксовой кислоты растворяют в 5 см3 0,05 моль/дм3 раствора гидроксида натрия и стерилизуют раствор путем фильтрования.
Б.3.2.4.2.2 Раствор цефтазидима
Состав:
цефтазидим . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,02 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 см3 |
Приготовление
Цефтазидим растворяют в 5 см3 дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.
Б.3.2.4.2.3 Раствор полимиксина B сульфата
Состав:
полимиксин B сульфат . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 76700,0 е.а. |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 см3 |
Приготовление
Полимиксин B сульфат растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.
Б.3.2.4.3 Растворы антибиотиков
Б.3.2.4.3.1 Раствор циклогексимида
Состав:
циклогексимид . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,05 г |
этанол . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 2,5 см3 |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 2,5 см3 |
Приготовление
Циклогексимид растворяют в 2,5 см3 этанола, затем добавляют 2,5 см3 дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.
Б.3.2.4.3.2 Раствор амфотерицина B (используют, как альтернативу для раствора циклогексимида)
Состав:
амфотерицин B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,01 г |
1 моль/дм3 раствора соляной кислоты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 2,5 см3 |
диметилформамид (DMF) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 7,5 см3 |
Приготовление
Амфотерицин B растворяют в растворе соляной кислоты и диметилформамида (DMF) и стерилизуют раствор путем фильтрования через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм.
Предупреждение - Раствор соляной кислоты и диметилформамид (DMF) очень токсичны. Обращаться с осторожностью.
Б.3.2.4.4 Дифференциальная добавка
Состав:
| 2,0 г |
холодная дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 50,0 см3 |
--------------------------------
<*> Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.
Приготовление
(Sigma P ) растворяют в холодной дистиллированной воде. Раствор перемешивают в течение 30 мин до получения гомогенной суспензии. Автоклавируют при температуре 121 °C в течение 15 мин с последующим охлаждением до температуры (47 +/- 2) °C.
Б.3.2.4.5 Готовая среда
Состав:
основа среды (см. Б.3.1.1.1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 933,0 см3 <*> |
раствор налидиксовой кислоты (см. Б.3.1.1.2.1) . . . . . . . . . . . . . | 5,0 см3 |
раствор цефтазидима (см. Б.3.1.1.2.2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 см3 |
раствор полимиксина B сульфата (см. Б.3.1.1.2.3) . . . . . . . . . . . . | 5,0 см3 |
раствор циклогексимида (см. Б.3.1.1.3.1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 см3 |
или амфотерицина B (см. Б.3.1.1.3.2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10,0 см3 |
дифференциальная добавка (см. Б.3.1.1.4) . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 50,0 см3 |
--------------------------------
<*> 925 см3, если используют раствор амфотерицина B.
Приготовление
В расплавленную и охлажденную на водяной бане до температуры (47 +/- 2) °C основу среды (см. Б.3.1.1.1) добавляют растворы ингибиторов (см. Б.3.1.1.2.1, Б.3.1.1.2.2, Б.3.1.1.2.3), антибиотиков (см. Б.3.1.1.3.1, Б.3.1.1.3.2) и дифференциальную добавку (см. Б.3.1.1.4), тщательно перемешивая после каждого добавления.
pH готовой среды должен составлять (7,2 +/- 0,2) ед. pH.
Готовая среда должна быть гомогенной и непрозрачной.
В стерильные чашки Петри разливают свежеприготовленную готовую среду приблизительно по 15 - 20 см3 и дают агару затвердеть.
Непосредственно перед применением среда в чашках должна быть подсушена в соответствии с ГОСТ ISO 11133.
Б.4 Питательные среды, используемые для изучения культурально-морфологических свойств
Б.4.1 Плотные питательные среды
Б.4.1.1 Триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA)
Состав:
триптон или панкреатический гидролизат казеина . . . . . . . . . . . | 17,0 г |
соевый пептон . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 3,0 г |
хлорид натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
калий фосфорнокислый двузамещенный . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 2,5 г |
глюкоза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 2,5 г |
дрожжевой экстракт . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 6,0 г |
агар . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 9,0 - 18,0 г <**> |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1000,0 см3 |
--------------------------------
<**> В зависимости от плотности среды.
Приготовление
Растворяют компоненты или сухую готовую среду в дистиллированной воде, нагревая. При необходимости устанавливают pH так, чтобы после стерилизации его значение соответствовало (7,3 +/- 0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Среду необходимого объема разливают в пробирки. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. Скашивают агар. Для приготовления чашек с агаром готовую среду разливают в стерильные чашки Петри в объеме, необходимом для проведения теста. Дают агару застыть.
Б.4.1.2 Трипказо-соевый агар (TSA)
Состав:
триптон . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 15,0 г |
соевый пептон . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
хлорид натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
агар . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1000,0 см3 |
Приготовление
Растворяют компоненты или сухую готовую среду в дистиллированной воде, нагревая. Устанавливают pH (7,3 +/- 0,2) ед. pH и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Приготовленную среду разливают в чашки Петри и хранят в защищенном от света месте при температуре не выше 8 °C.
Б.4.1.3 Мясопептонный агар (МПА)
Готовят по ГОСТ 10444.1-84 (подраздел 5.12).
Б.4.2 Жидкие питательные среды
Б.4.2.1 Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEB)
Состав:
триптон или панкреатический гидролизат казеина . . . . . . . . . . | 17,0 г |
соевый пептон . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 3,0 г |
хлорид натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
калий фосфорнокислый двузамещенный . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 2,5 г |
глюкоза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 2,5 г |
дрожжевой экстракт . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 6,0 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1000,0 см3 |
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, при необходимости нагревая. Устанавливают pH (7,3 +/- 0,2) ед. pH. Среду разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Б.4.2.2 Трипказо-соевый бульон (TSB)
Состав:
триптон . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 17,0 г |
соевый пептон . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 3,0 г |
хлорид натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
калий фосфорнокислый однозамещенный . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 2,5 г |
декстроза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 2,5 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1000,0 см3 |
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, при необходимости нагревая. Устанавливают pH (7,3 +/- 0,2) ед. pH. Среду разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Приготовленную среду хранят в защищенном от света месте при температуре не выше 8 °C.
Б.4.2.3 Мясопептонный бульон (МПБ)
Готовят по ГОСТ 10444.1-84 (подраздел 5.12).
Б.5 Среда для определения 
активности
Б.5.1 Кровяной агар
Б.5.1.1 Основа среды (вариант 1)
Состав:
мясной пептон . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 15,0 г |
печеночный перевар . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 2,5 г |
дрожжевой экстракт . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
хлорид натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
агар . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 9,0 - 18,0 г <*> |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1000,0 см3 |
--------------------------------
<*> В зависимости от плотности среды.
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, нагревая на водяной бане. При необходимости устанавливают pH так, чтобы после стерилизации его значение соответствовало (7,2 +/- 0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Среду разливают в колбы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Б.5.1.2 Основа среды (вариант 2)
Состав и приготовление согласно ГОСТ 10444.1-84 (подраздел 5.12).
Б.5.1.3 Дефибринированная кровь барана
Приготовление.
В стерильную колбу со стеклянными бусами вливают 8 см3 только что взятой крови барана и непрерывно встряхивают в течение 10 - 15 мин, в результате чего находящийся в крови фибрин выпадает в осадок, обволакивая бусы. Дефибринированную кровь сливают в другую колбу или пробирку. Слитая дефибринированная кровь утрачивает способность свертываться и может храниться при температуре (4 +/- 1) °C в течение одной недели.
Б.5.1.4 Готовая среда
Состав:
основа среды (см. Б.5.1.1 или Б.5.1.2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 100 см3 |
дефибринированная кровь барана . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 - 7,0 см3 |
Приготовление
В основу среды (см. Б.5.1.1 или Б.5.1.2), охлажденную на водяной бане до температуры (47 +/- 2) °C, добавляют дефибринированную кровь барана (см. Б.5.1.3). Среда должна иметь pH (7,2 +/- 0,2) ед. pH.
Готовую среду осторожно перемешивают и разливают в чашки Петри (не более 10 см3 на чашку) и после затвердения агара подсушивают его при температуре (47 +/- 2) °C в течение 30 мин или в ламинарном боксе в течение 1 - 2 ч или в других условиях, обеспечивающих испарение конденсационной влаги и исключающих микробное загрязнение.
Среду в чашках хранят при температуре (4 +/- 1) °C не более двух суток.
Слой агара в чашке Петри должен быть равномерно окрашен в красный цвет. Для посева должна использоваться подсушенная среда.
Б.6 Суспензия из эритроцитов барана для определения гемолитической активности
Приготовление
Кровь из яремной вены барана отбирают в стерильную банку с бусами и дефибринируют (см. Б.5.1.3). Эритроциты трижды отмывают изотоническим раствором хлорида натрия путем центрифугирования при 1000 - 2000 об/мин в течение 5 - 10 мин соответственно. После последнего центрифугирования надосадочная жидкость должна быть прозрачной. Красный цвет жидкости (гемолиз) свидетельствует о непригодности эритроцитов к применению. Отмытые эритроциты барана необходимо хранить при температуре (3 +/- 2) °C не более двух суток.
Если гемолиз эритроцитов барана не наблюдается, необходимо внести 2 см3 кровяных телец в 98 см3 фосфатно-солевого буфера (PBS) (см. Б.11).
Если гемолиз эритроцитов наблюдается, необходимо внести около 4 см3 слоя кровяных телец в 10 см3 фосфатно-солевого буфера (PBS) (см. Б.11) и осторожно перемешать, а затем центрифугировать. Если жидкость на поверхности стала четко красного цвета благодаря выраженному гемолизу, не допускается использование такой суспензии эритроцитов, она должна утилизироваться.
Суспензию эритроцитов барана необходимо хранить при температуре (3 +/- 2) °C не более пяти суток.
Б.7 Среды для определения ферментативных свойств
Б.7.1 Бульон с бромкрезоловым пурпурным
Б.7.1.1 Основа среды
Состав:
протеозный пептон . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10,0 г |
мясной экстракт . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1,0 г |
хлорид натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
бромкрезоловый пурпурный . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,02 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1000,0 см3 |
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (6,8 +/- 0,2) ед. pH. Разливают среду в пробирки соответствующего объема и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.7.1.2 Растворы углеводов
Состав:
углевод <*> . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 100 см3 |
--------------------------------
<*> L-рамноза, D-ксилоза.
Приготовление
Каждый из углеводов отдельно растворяют в 100 см3 дистиллированной воды и стерилизуют раствор путем фильтрования.
Б.7.1.3 Готовая среда
Состав:
основа среды (см. Б.7.1.1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 9,0 см3 |
углевод (см. Б.7.1.2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1,0 см3 |
Приготовление
В асептических условиях в основу среды (см. Б.7.1.1) перед применением добавляют раствор каждого углевода (см. Б.7.1.2) в отдельности.
Б.7.2 Среды Гисса
Состав и приготовление в соответствии с ГОСТ 10444.1.
Углеводы: L-рамноза, D-ксилоза.
Б.8 Агар для определения подвижности культуры микроорганизма
Состав:
ферментативный гидролизат казеина . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 20,0 г |
пептон . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 6,1 г |
агар-агар . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 3,5 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1000,0 см3 |
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде при нагревании.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (7,3 +/- 0,2) ед. pH. Разливают среду в пробирки соответствующего объема в количестве 5 см3 и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.9 Среды для проведения КАМП-теста (CAMP)
Для проведения КАМП-теста могут быть использованы чашки Петри с кровяным агаром (см. Б.5.1), но предпочтительнее использовать чашки с двойным слоем: среды (см. Б.5.1.1 или Б.5.1.2) и тонкого слоя кровяного агара (см. Б.5.1).
Среду (см. Б.5.1.1 или Б.5.1.2) разливают примерно по 10 см3 в стерильные чашки Петри и дают застыть. Затем очень тонким слоем заливают кровяной агар (см. Б.5.1), но не более 3 см3 на чашку. Дают агару застыть.
Если кровяной агар (см. Б.5.1) вносится в заранее приготовленные чашки со средой (см. Б.5.1.1 или Б.5.1.2), то перед тем, как внести ее, необходимо прогреть эти чашки в течение 20 мин в термостате при температуре 37 °C.
Б.10 Среда для определения лецитиназной активности
Б.10.1 Лецитин-агар с активированным углем
Б.10.1.1 Основа среды
Состав:
панкреатический гидролизат рыбной муки . . . . . . . . . . . . . . . . | 15,0 г |
панкреатический гидролизат казеина . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10,0 г |
экстракт дрожжевой . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 2,0 г |
натрий хлорид . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 3,5 г |
глюкоза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1,0 г |
агар . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10,0 +/- 2,0 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1000 см3 |
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, кипятят в течение 2 мин до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в стерильные колбы и флаконы и стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.10.1.2 Активированный уголь
Активированный уголь растирают до порошкообразного состояния.
Б.10.1.3 Эмульсия яичного желтка
Поверхность яйца обрабатывают этиловым спиртом, стерильным пинцетом пробивают с двух сторон отверстия и через одно из них полностью удаляют белок. Желток выливают в стерильную колбу.
Для приготовления желточной эмульсии к одному желтку с соблюдением правил асептики добавляют 150 см3 стерильного физиологического раствора и тщательно перемешивают до получения однородной массы.
Б.10.1.4 Готовая среда
Состав:
основа среды (см. Б.10.1.1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 100 см3 |
активированный уголь (см. Б.10.1.2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 0,5 г |
желточная эмульсия (см. Б.10.1.3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5 см3 |
Приготовление
Расплавленную основу среды (см. Б.10.1.1) охлаждают до температуры (47 +/- 2,0) °C, добавляют активированный уголь (см. Б.10.1.2) и желточную эмульсию (см. Б.10.1.3), тщательно перемешивают и разливают по (20 +/- 5) см3 в стерильные чашки Петри и после застывания подсушивают в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение (40 +/- 5) мин.
Б.10.2 Лецитин-агар без угля
Б.10.2.1 Основа среды
Состав:
панкреатический гидролизат рыбной муки . . . . . . . . . . . . . . . . . | 15,0 г |
панкреатический гидролизат казеина . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10,0 г |
экстракт дрожжевой . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 2,0 г |
натрий хлорид . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 3,5 г |
глюкоза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1,0 г |
агар . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | (10,0 +/- 2,0) г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1000 см3 |
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде, кипятят в течение 2 мин до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в стерильные колбы и флаконы и стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.10.2.2 Эмульсия яичного желтка
Поверхность яйца обрабатывают этиловым спиртом, стерильным пинцетом пробивают с двух сторон отверстия и через одно из них полностью удаляют белок. Желток выливают в стерильную колбу.
Для приготовления желточной эмульсии к одному желтку с соблюдением правил асептики добавляют 150 см3 стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS) (см. Б.11) и тщательно перемешивают до получения однородной массы.
Б.10.2.3 Готовая среда
Состав:
основа среды (см. Б.10.2.1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 100 см3 |
желточная эмульсия (см. Б.10.2.2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5 см3 |
Приготовление
Расплавленную основу среды (см. Б.10.2.1) охлаждают до температуры (47 +/- 2,0) °C, добавляют желточную эмульсию (см. Б.10.2.2), тщательно перемешивают и разливают по (20 +/- 5) см3 в стерильные чашки Петри и после застывания подсушивают в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение (40 +/- 5) мин.
Б.10.3 Среда и реактивы для реакции Фогеса-Проскауэра (VP)
Б.10.3.1 Основа среды
Состав:
протеозный пептон . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 7,0 г |
хлорид натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
глюкоза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1000 см3 |
Приготовление
Компоненты растворяют в дистиллированной воде, нагревая при необходимости.
Устанавливают pH среды таким образом, чтобы после стерилизации его значение составляло (6,9 +/- 0,2) ед. pH при 25 °C. Разливают среду в пробирки по 3 см3 и стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.10.3.2 Спиртовой раствор 
Состав:
| 5,0 г |
этанол, 96% (объемная доля) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 100 см3 |
Приготовление
Растворяют 
в этаноле.
Б.10.3.3 Раствор гидроксида калия
Состав:
гидроксид калия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 40,0 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 100 см3 |
Приготовление
Растворяют гидроксид калия в дистиллированной воде.
Б.11 Фосфатно-солевой буфер (PBS)
Состав:
натрий фосфорнокислый двузамещенный . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 8,98 г |
натрий фосфорнокислый однозамещенный . . . . . . . . . . . . . . . . . | 2,71 г |
хлорид натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 8,5 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1000,0 см3 |
Приготовление
Компоненты растворяют в дистиллированной воде. При необходимости устанавливают pH так, чтобы после стерилизации его значение соответствовало (7,2 +/- 0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Б.12 Универсальный нейтрализатор
Б.12.1 Основа среды
Состав:
пептон . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1,0 г |
хлорида натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 8,5 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1000 см3 |
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде.
Б.12.2 Готовая среда
Состав:
основа среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1000 см3 |
сорбитан моноолеат . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 30,0 г |
лецитин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 3,0 г |
тиосульфат натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
гистидинт . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1,0 г |
сапонин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 30,0 г |
Приготовление
Компоненты растворяют в основе среды. Готовый раствор разливают в пробирки или бутылки и стерилизуют в течение 15 мин при температуре 121 °C.
Примечание - Допускается применение других нейтрализаторов или их комбинаций в отношении известного дезинфицирующего средства.
Б.13 Пептонная вода
Состав:
пептон . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 10,0 г |
хлористый натрий . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 5,0 г |
фосфорнокислый натрий двузамещенный 12-водный . . . . . . . . | 9,0 г |
фосфорнокислый калий однозамещенный . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1,5 г |
дистиллированная вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . | 1000 см3 |
Приготовление
Компоненты или сухую готовую среду растворяют в дистиллированной воде. При необходимости устанавливают pH так, чтобы после стерилизации его значение соответствовало (7,0 +/- 0,2) ед. pH при температуре 25 °C. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Подписаться на обновления