ГОСТ 32031-2022. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые. Методы выявления бактерий Listeria monocytogenes и других видов Listeria (Listeria spp.)
9 Проведение испытания
Схема проведения испытания пищевой продукции и смывов приведена в приложении А.
9.1 Проба для анализа и исходная суспензия
Анализируемую пробу X (г или см3) вносят в селективную среду первичного обогащения, исходя из соотношения продукта и среды 1:9.
Смывы, отобранные по 8.2, вносят в селективную среду первичного обогащения согласно приложению Б.
9.2 Первичное обогащение
Исходную суспензию (см. 9.1) культивируют при температуре (30 +/- 1) °C в течение (25 +/- 1) ч.
9.3 Вторичное обогащение
9.3.1 Посевной материал, полученный по 9.2 в объеме 0,1 см3, пересевают в пробирку, содержащую 10 см3 среды селективного обогащения (см. 6.3).
9.3.2 Посевы (см. 9.3.1) культивируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 2) ч (для бульона Фразера). В случае использования другой селективной жидкой питательной среды продолжительность культивирования согласно инструкции производителя.
Примечание - Посевы на питательных средах первичного и вторичного обогащения после окончания культивирования перед пересевом на плотные селективные среды допускается хранить при температуре не выше 5 °C не более 72 ч.
9.4 Пересев на плотные селективные среды
9.4.1 Посевной материал, полученный после первичного и вторичного обогащения (см. 9.2 и 9.3) с помощью бактериологической петли, пересевают на поверхность первой плотной селективной среды <*> (см. 6.4.1) так, чтобы получить хорошо изолированные колонии.
--------------------------------
<*> Допускается в Российской Федерации не использовать.
Аналогичным образом проводят пересев и на вторую плотную селективную среду (см. 6.4.2, или 6.4.3, или 6.4.4, или 6.4.5).
9.4.2 Чашки с посевами на первой плотной селективной среде (см. 9.4.1) культивируют в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 - 48 ч.
Чашки с посевами на второй плотной селективной среде инкубируют согласно инструкции производителя питательных сред.
9.4.3 Через (24 +/- 3) ч или (48 +/- 2) ч [если после (24 +/- 3) ч отмечен слабый рост культуры или его отсутствие] культивирования на первой и второй плотной селективной средах (10.4) учитывают наличие колоний с ростом характерных для бактерий рода Listeria и Listeria monocytogenes.
9.4.3.1 На первой селективной плотной среде бактерии вида L. monocytogenes и L. ivanovii растут в виде сине-зеленых колоний, окруженные непрозрачным ореолом (типичные колонии). Другие виды бактерий рода Listeria также растут в виде сине-зеленых колоний, но без ореола.
Примечания
1 Некоторые штаммы L. monocytogenes могут давать очень слабый ореол помутнения питательного агара вокруг колонии или вовсе не иметь его. Это характерно для "поврежденных" клеток L. monocytogenes (например, вследствие воздействия кислот).
2 Некоторые штаммы L. monocytogenes характеризуются пониженной фосфатидилинозитолфосфолипазной C активностью. Для выявления таких штаммов требуется более продолжительное культивирование.
3 После инкубации посевы на плотных селективных средах до начала следующих тестов допускается хранить не более двух дней при температуре 5 °C.
9.4.3.2 Посевы на второй плотной селективной среде просматривают на наличие колоний с ростом, характерным для бактерий рода Listeria.
На Палкам агаре все виды бактерий рода Listeria формируют мелкие серовато-зеленые или оливково-зеленые колонии с черным ореолом, иногда с черным центром.
На Оксфорд агаре все виды бактерий рода Listeria формируют мелкие сероватые колонии, окруженные черным ореолом.
На ПАЛ все виды бактерий рода Listeria формируют мелкие серовато-желтые колонии с черным ореолом.
На Бриллианс Listeria агаре (BRILLIANCE LISTERIA agar) бактерии L. monocytogenes и L. ivanovii растут в виде сине-зеленых колоний, окруженные непрозрачным ореолом (типичные колонии). Другие виды бактерий рода Listeria растут в виде сине-зеленых колоний, но без ореола.
9.4.3.3 При отсутствии колоний с ростом, характерным для Listeria monocytogenes и рода Listeria (Listeria spp.) как на первой, так и на второй плотных селективных средах, исследование прекращают и делают заключение, в зависимости от поставленной задачи, об отсутствии в исследуемой пробе бактерий Listeria monocytogenes или рода Listeria (Listeria spp.).
9.5 Подтверждение принадлежности выделенных культур к роду Listeria
9.5.1 Выбор колоний для подтверждения
9.5.1.1 С каждой чашки с плотной селективной средой (см. 9.4.3) отбирают по пять колоний с ростом, характерным для бактерий рода Listeria.
Если на чашке выросло менее пяти типичных колоний, отбирают их все.
9.5.1.2 Отобранные колонии пересевают на поверхность подсушенного плотного неселективного питательного агара (см. 6.5.1.1 - 6.5.1.3) так, чтобы получить изолированные колонии.
Посевы культивируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч.
На плотных неселективных питательных средах бактерии Listeria spp. растут в виде выпуклых, бесцветных и непрозрачных колоний в диаметре от 1,0 до 2,0 мм. Когда чашку Петри просматривают на свету (искусственном или естественном) под углом около 45°, колонии имеют сине-серый цвет и зернистую поверхность.
Достаточно одной подтвержденной типичной колонии на образец. Если первая колония будет отрицательна, для проведения идентификации используют остальные отобранные колонии.
Для подтверждения принадлежности выделенной культуры к бактериям рода Listeria проводят тесты, приведенные в таблице 1.
Таблица 1
Подтверждающие тесты на бактерии рода Listeria
Статус тестов | Тесты для идентификации бактерий рода Listeria | Результаты |
Обязательные | Микроскопия | Тонкие короткие грамположительные палочки или коккобациллы |
Реакция на каталазу | + | |
Необязательные | VP тест | + |
Подвижность при 25 °C | + |
9.5.2 Микроскопия
Культуры, выделенные по 9.5.1.2, окрашивают по Граму согласно ГОСТ 30425 или ГОСТ ISO 7218 и микроскопируют.
Бактерии рода Listeria spp. представляют собой грамположительные тонкие, короткие палочки или коккоподобные палочки.
9.5.3 Реакция на каталазу
Берут изолированную колонию, выделенную по 9.5.1.2, и вносят в каплю 3%-ного раствора перекиси водорода (см. 6.6.1). Мгновенное образование пузырьков газа указывает на положительную реакцию.
Бактерии Listeria spp. являются каталазоположительными.
9.5.4 Реакция Фогеса-Проскауэра (VP)
Пробирку, содержащую 3 см3 среды VP (см. Б.10.3.1) инокулируют с помощью петли культурой, полученной по 9.5.1.2, и инкубируют при температуре 37 °C в течение (24 +/- 3) ч. После инкубации добавляют 0,6 см3 5%-ного раствора 
(см. Б.10.3.2) и 0,2 см3 40%-ного раствора гидроксида калия (см. Б.10.3.3), хорошо встряхивают, наклоняя пробирку, чтобы увеличить площадь поверхности раздела воздух - жидкость и учитывают результат через 15 мин и 1 ч. Положительная реакция обозначена ярко-красным цветом раствора.
9.5.5 Определение подвижности
Культуру, выделенную по 9.5.1.2, пересевают в жидкую неселективную питательную среду (см. 6.5.2).
Посевы культивируют при температуре (25 +/- 1) °C от 8 до 24 ч до появления мутности в бульоне. Затем каплю культуральной жидкости помещают на предметное стекло, накрывают сверху покровным стеклом и микроскопируют.
В поле зрения микроскопа должны наблюдаться короткие палочки с опрокидывающими движениями.
При культивировании посевов в жидкой питательной среде при температуре выше (25 +/- 1) °C подвижность бактерий не наблюдается.
В качестве альтернативного теста определения подвижности можно использовать посев культуры уколом в питательную среду (см. 6.6.4).
Посевы культивируют в термостате при температуре (25 +/- 1) °C в течение 48 ч.
Бактерии Listeria spp. подвижны при температуре (25 +/- 1) °C, образуют характерный рост вокруг линии укола, похожий на зонтик. Если рост слабый, необходимо культивировать еще пять суток с ежедневным просмотром посевов.
9.6 Подтверждение Listeria monocytogenes
Для подтверждения Listeria monocytogenes культуры, выделенной по 9.5.1.2, проводят тесты, приведенные в таблице 2.
Таблица 2
Подтверждающие тесты на L. monocytogenes
Статус тестов | Тесты для идентификации L. monocytogenes | Результаты |
Обязательные | Микроскопия <*> | Тонкие короткие грамположительные палочки или коккобациллы |
B-гемолиз | + | |
Ферментация L-рамнозы | + | |
Ферментация D-ксилозы | - | |
Необязательные | Реакция на каталазу | + |
Подвижность при 25 °C | + | |
КАМП-тест | + | |
<*> Микроскопия необязательна для колоний, отобранных с первой и для второй плотной селективной среды, если они позволяют различать патогенные и непатогенные виды Listeria spp. | ||
9.6.1 Определение бета-гемолитической активности
9.6.1.1 С использованием кровяного агара
Поверхность кровяного агара (см. 6.7.1.1) перед использованием необходимо тщательно подсушить. Чашку с тыльной стороны целесообразно разделить на квадраты и проколоть каждый маркированный квадрат бактериальной иглой с колонией культуры, полученной по 9.5.1.2. На каждую чашку с кровяным агаром, кроме исследуемых культур, должны быть посеяны контрольные штаммы, такие как L. monocytogenes (положительный контроль) и L. innocua (отрицательный контроль).
Посевы культивируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 2) ч.
Зона 
на кровяном агаре у культуры L. monocytogenes - в виде узкой, чистой, светлой зоны; L. innocua - нет зоны гемолиза вокруг укола; L. seeligeri - слабая зона гемолиза; L. ivanovii - широкая, четко обозначенная зона гемолиза.
После инкубирования проводят визуальное сравнение прозрачности зон вокруг анализируемых и контрольных культур.
Примечание - Зона более четко видна при удалении колонии с поверхности агара вокруг места посева.
9.6.1.2 С использованием суспензии эритроцитов барана
В 0,15 см3 жидкой неселективной питательной среды (см. 6.5.2) необходимо внести одну колонию культуры, полученную по 9.5.1.2.
Посевы культивируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 ч. Затем добавляют 0,15 см3 суспензии эритроцитов барана (см. 6.7.1.2) и продолжают культивирование при температуре (37 +/- 1) °C от 15 до 60 мин, с последующим охлаждением при температуре (3 +/- 2) °C около 2 ч.
При наличии у культуры гемолитической активности - жидкость окрашена в соломенно-коричневый цвет и отсутствует осадок красных кровяных клеток на дне лунки.
При отсутствии гемолитической активности наблюдается осадок красных кровяных клеток на дне лунки. Клетки могут быть красно-коричневыми по цвету.
Если реакция неопределенная, следует оставить культуру при температуре (3 +/- 2) °C на 24 ч.
9.6.2 Определение лецитиназной активности (при необходимости)
При необходимости изучения лецитиназной активности культуры, полученной по 9.5.1.2, можно использовать лецитин-агар с активированным углем и без угля.
Поверхность лецитин-агара с активированным углем и без угля (см. 6.6.5) перед использованием необходимо тщательно подсушить. Чашку с тыльной стороны целесообразно разделить на квадраты и высевать на каждый маркированный квадрат бактериологической петлей колонию культуры, полученной по 9.5.1.2. На каждую чашку с лецитин-агаром с активированным углем и без угля, кроме исследуемых культур, должен быть посеян контрольный штамм L. monocytogenes (положительный контроль).
Посевы культивируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (48 +/- 2) ч.
L. monocytogenes при росте дает плотную зону помутнения шириной 3,0 - 6,0 мм на лецитин-агаре с активированным углем за счет гидролиза лецитина.
L. monocytogenes при росте не дает плотную зону помутнения на лецитин-агаре без активированного угля.
9.6.3 Определение ферментативных свойств L. monocytogenes
У культур, полученных по 9.5.1.2, определяют ферментативные свойства. Для этого используют суточную культуру.
Посевы следует культивировать при температуре (37 +/- 1) °C.
Положительную реакцию в отношении углеводов определяют по изменению окраски среды в желтый цвет за счет образования кислоты. Изменение цвета среды происходит, как правило, в течение 24 - 48 ч. При использовании микрообъемов питательных сред ферментативные реакции протекают быстрее. Продолжительность культивирования согласно инструкции производителя питательных сред.
9.6.4 КАМП-тест
В случае возникновения сомнений при интерпретации результатов гемолитического теста допускается использовать КАМП-тест как вспомогательный тест.
Существуют редкие штаммы L. monocytogenes, которые не показывают 
или положительную реакцию на КАМП-тесте в условиях, описанных в настоящем стандарте.
Двухсуточные культуры гемолитических штаммов Staphylococcus aureus и Rhodococcus equi высевают на кровяной агар, как показано на рисунке 1.
Рисунок 1 - Посев и интерпретация КАМП-теста
Между вертикальными линиями Staphylococcus aureus и Rhodococcus equi засевают параллельными линиями исследуемые культуры на расстоянии друг от друга не менее 1 см и от вертикальных линий - 0,5 см.
Посевы культивируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 ч.
Для положительного контроля рекомендуется провести посев тест-штамма Listeria monocytogenes аналогично посеву исследуемых культур.
После культивирования посевов отмечают изменение (расширение и просветление) зоны гемолиза в зонах, соседствующих с вертикальными штрихами Staphylococcus aureus и Rhodococcus equi.
Listeria monocytogenes дает положительную реакцию (расширение и просветление зоны гемолиза) около штриха Staphylococcus aureus и отрицательную (отсутствие изменений в зоне гемолиза) - около штриха Rhodococcus equi.
9.7 Интерпретация морфологических и физиологических свойств и биохимических реакций
Все Listeria spp. - мелкие, грамположительные коккоподобные палочки, которые дают положительную реакцию VP и являются каталазоположительными.
L. monocytogenes отличаются от других видов Listeria spp. биохимическими свойствами, указанными в таблице 3.
Таблица 3
Биохимические свойства различных видов бактерий
рода Listeria
Виды | Реакция на | Ферментация | КАМП-тест | ||
рамноза | ксилоза | S. aureus | R. equi | ||
L. monocytogenes | + | + | - | + | - |
L. innocua | - | V | - | - | - |
L. ivanovii | + | - | + | - | + |
L. seeligeri | (+) | - | + | (+) | - |
L. welshimeri | - | V | + | - | - |
L. grayisubsp. grayi | - | - | - | - | - |
L. grayisubsp. murrayi | - | V | - | - | - |
Примечание - В данной таблице приведены следующие обозначения: "V" - вариабельная реакция; "(+)" - слабая реакция; "+" - > 90% положительных реакций; "-" - нет реакции. | |||||
Примечание - Для изучения биохимических свойств выделенных по 9.5.1.2 колоний можно использовать следующие коммерческие тест-системы: Listeria ID MID-67, Microbact 12L, API Listeria и другие тест-системы, валидированные по ГОСТ ISO 16140.
9.8 Ускоренное обнаружение и идентификация бактерий Listeria spp. и Listeria monocytogenes с использованием различных тестов и тест-систем
Для ускоренного обнаружения (скрининга) и идентификации Listeria spp. и Listeria monocytogenes допускается использование валидированных по ГОСТ ISO 16140 тестов и тест-систем в соответствии с инструкциями производителя, в том числе следующих.
9.8.1 Идентификация бактерий до рода Listeria
Listeria Latex Kit.
Singlepath Listeria.
VIDAS Listeria Duo (LDUO).
Анализатор GENE-UP.
API Listeria.
Listeria ID MID-67.
Microbact 12L.
9.8.2 Идентификация бактерий Listeria monocytogenes
VIDAS Listeria monocytogenes II (LMO2).
VIDAS L. monocytogenes Xpress (LMX).
Singlepath L'mono.
API Listeria.
Listeria ID MID-67.
Microbact 12L.
BAX System PCR assay for L. monocytogenes.
BAX System PCR assay for L. monocytogenes 24E.
TaqMan Listeria monocytogenes Detection Kit и Prep Man Ultra Sample Preparation Reagent.
Food proof Listeria monocytogenes Detection Kit, 5'nuclease.
MDS Система молекулярного анализа.
Vitek 2 Compact.
MALDI-TOF масс-спектрометрический анализатор.
ПЦР-РВ: "
Listeria monocytogenes-скрин/монитор-FL" (ООО "Интерлабсервис"); "Listeria monocytogenes" (ООО "ДНК-Технология").
9.9 Типирование выделенных штаммов Listeria monocytogenes
По эпидемиологическим показаниям штаммы, идентифицированные как L. monocytogenes, направляют в референс лаборатории для серотипирования и/или генотипирования.
Подписаться на обновления