ГОСТ 34786-2021. Межгосударственный стандарт. Вода питьевая. Методы определения общего числа микроорганизмов, колиформных бактерий, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и энтерококков

5 Подготовка к анализу

 

5.1 Посуда, применяемая для микробиологического анализа (пробирки, колбы, флаконы), должна проходить соответствующую подготовку, гарантирующую ее чистоту и стерильность. Стерилизованная посуда должна иметь маркировку с указанием даты стерилизации для последующего учета срока хранения.

Срок хранения стерильной посуды многоразового использования - не более 10 дней.

5.2 Перед стерилизацией посуда для микробиологического анализа должна быть тщательно вымыта и высушена. Посуду стерилизуют в сушильном шкафу сухим жаром одним из способов:

- при температуре (180 +/- 3) °C - в течение 1 ч с момента достижения указанной температуры;

- при температуре (160 +/- 5) °C - в течение 2,5 ч с момента достижения указанной температуры.

5.3 Материалы и лабораторную посуду, разрушающиеся при температуре от 160 °C до 180 °C (резина и т.п.), следует стерилизовать в паровом стерилизаторе при температуре (121 +/- 3) °C в течение 20 мин.

После окончания анализа использованную лабораторную посуду с содержимым обеззараживают автоклавированием при температуре (126 +/- 2) °C и давлении 0,15 МПа в течение 60 мин или (132 +/- 2) °C и давлении 0,2 МПа в течение 20 мин с момента достижения указанной температуры; при росте споровой микрофлоры - при температуре (132 +/- 2) °C и давлении 0,2 МПа в течение 90 мин с момента достижения указанной температуры.

5.4 Мойку лабораторной посуды после обеззараживания проводят с использованием моющих средств, не содержащих фосфаты, и тщательно промывают проточной водопроводной водой (не менее 10 раз), ополаскивают дистиллированной водой, высушивают и стерилизуют.

5.5 Для определения качества удаления синтетических моющих и моюще-дезинфицирующих средств используют индикаторную бумагу с шагом измерительного диапазона не более 0,3 ед. pH. Предварительно определяют pH воды, применяемой для ополаскивания посуды на конечном этапе. Контрольные измерения pH проводят путем прикладывания индикаторной бумаги к поверхности вымытого мокрого стекла, прошедшего обработку. Для контроля произвольно выбирают три - десять единиц посуды. Значение pH воды, полученной в результате контроля, должно соответствовать pH дистиллированной воды, примененной для ополаскивания.

5.6 Использованные пипетки многоразового применения погружают в рабочий раствор дезинфицирующего средства, разрешенного к применению, и выдерживают определенное время в соответствии с инструкцией. После обеззараживания пипетки тщательно промывают проточной водопроводной водой до полного удаления дезинфицирующего средства, после чего два-три раза промывают дистиллированной водой и высушивают. Возможны альтернативные методы обеззараживания пипеток, например автоклавированием.

5.7 После высушивания чашки Петри, пробирки, пипетки укладывают в металлические пеналы или заворачивают в бумагу или металлическую фольгу. Бумага, используемая для обертывания лабораторной посуды, не должна разрушаться при стерилизации.

Утилизацию посуды одноразового применения и использованных тест-систем проводят в соответствии с требованиями к обращению с медицинскими отходами.

5.8 Подготовка мембранных фильтров

5.8.1 Подготовку мембранных фильтров проводят в соответствии с рекомендациями производителя. Если производитель поставляет нестерильные фильтры, то до начала анализа фильтры помещают в емкость (из нейтрального материала) с небольшим количеством дистиллированной воды, нагревают, не допуская закипания, накладывая на поверхность воды по одному мембранному фильтру. Затем кипятят на очень слабом огне в течение 7 мин, не допуская бурного кипения, сливая после каждого кипячения воду. Процедуру замены воды повторяют три раза, после последнего кипячения воду не сливают. Простерилизованные фильтры используют непосредственно после стерилизации. Допускается их хранение после высушивания в асептических условиях. Перед употреблением проводят однократно процедуру стерилизации кипячением в дистиллированной воде.

5.8.2 Перед началом исследований мембранные фильтры проверяют визуально на отсутствие трещин, отверстий и др. дефектов.

5.9 Подготовка аппарата для фильтрования и фильтрация

5.9.1 Перед посевом воды фильтровальный аппарат обтирают ватным тампоном, смоченным 96%-ным этиловым спиртом, и стерилизуют фламбированием. После сгорания спирта и последующего охлаждения на нижнюю часть фильтровального аппарата (столик) кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его фильтровальной воронкой или стаканом и закрепляют одним из способов, предусмотренных конструкцией фильтрующего устройства.

5.9.2 В воронку аппарата при соблюдении правил стерильности наливают отмеренный объем воды, создают разрежение и отфильтровывают содержимое воронки.

Чтобы обеспечить равномерное распределение бактерий на поверхности фильтра, при фильтровании 1 см³ пробы воды в воронку сначала наливают (15 +/- 5) см³ (в зависимости от используемого диаметра фильтра) стерильной водопроводной воды, а затем вносят анализируемую воду.

При посеве нескольких объемов из одной пробы воды фильтрование проводят через один аппарат без повторной стерилизации фламбированием. Сначала фильтруют меньшие, а затем большие объемы воды, используя для каждого объема отдельный фильтр. Перед фильтрованием новой пробы воды аппарат стерилизуют фламбированием.

5.9.3 По окончании фильтрования и осушения фильтра отключают вакуум, воронку снимают, фильтр осторожно поднимают за край фламбированным пинцетом и переносят его, не переворачивая, на питательную среду, разлитую в чашки Петри, добиваясь отсутствия пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.

Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, номера пробы и даты посева. На одну чашку допускается помещать от двух до четырех фильтров (в зависимости от диаметра фильтров и чашки Петри) с условием, чтобы фильтры не соприкасались.

5.10 Приготовление питательных сред и реактивов

5.10.1 Приготовление питательных сред и реактивов проводят по ГОСТ 31955.1, ГОСТ ISO 11133, ГОСТ ISO 7899-2, а также в соответствии с инструкциями производителя.

Питательные среды, которые в соответствии с указанием производителя не требуют стерилизации автоклавированием, а также среды с коротким сроком хранения после розлива в чашки Петри, могут быть приготовлены непосредственно перед анализом. Такие среды готовят в эмалированной или стеклянной емкости, или емкости из нержавеющей стали.

При использовании промышленных сухих питательных сред их готовят в соответствии с указаниями изготовителя. В этом случае следует соблюдать способ применения и срок хранения питательных сред, указанных на упаковках.

Питательные среды, разлитые в чашки и хранящиеся в холодильнике, перед посевом должны быть прогреты до комнатной температуры.

При наличии следов влаги на поверхности агаризованных сред проводят подсушивание в термостате, приоткрывая крышку, до исчезновения конденсата.

5.10.2 Подготовленные заранее стерильные емкости, питательные среды, лабораторную посуду и реактивы следует хранить в условиях, предусмотренных для каждого средства, среды и реактива с соблюдением стерильности и предельных сроков хранения. При этом емкости и пробирки с готовыми средами должны быть закрыты силиконовыми пробками и защищены колпачками из силикона или жароустойчивой бумаги или металлической фольгой. Чашки Петри с готовыми средами должны быть помещены в специальные пакеты или завернуты в плотную бумагу, защищающую среду от высыхания и воздействия света.

При вскрытии упаковок и емкостей, удалении пробок (крышек) непосредственно перед проведением анализа, пробка (крышка) и края емкости не должны касаться посторонних поверхностей.

5.10.3 Операции по подготовке и проведению анализа выполняют чистыми и продезинфицированными руками (например, после обработки рук 70%-ным этиловым спиртом или дезинфицирующими салфетками для индивидуального пользования) или в стерильных перчатках.

5.11 Приготовление разведений пробы воды

Для приготовления разведений анализируемой воды используют стерильные растворы для разведения: солевой (физиологический раствор, пептонный раствор или пептонно-солевой раствор).

При посеве проб воды объемом менее 0,1 и 1,0 см³ используют разведения (1:9 и более) анализируемой воды. Для этого в пробирку с 9 см³ раствора для разведения вносят 1 см³ анализируемой воды. Пипетка не должна касаться поверхности раствора, чтобы избежать смывания бактерий с наружной стороны. Другой стерильной пипеткой содержимое пробирки тщательно перемешивают многократным пипетированием или используя альтернативные методы (например, ротационные миксеры, вортексы), получая десятикратное разведение. Посев в питательную среду 1 см³ этого разведения будет соответствовать посеву 0,1 см³ анализируемой воды. При необходимости посева меньших объемов воды этой же пипеткой переносят 1 см³ содержимого первой пробирки в следующую пробирку с 9 см³ стерильного раствора. Посев 1 см³ второго разведения будет соответствовать посеву 0,01 см³ анализируемой воды.