ГОСТ 34786-2021. Межгосударственный стандарт. Вода питьевая. Методы определения общего числа микроорганизмов, колиформных бактерий, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и энтерококков

12 Методы определения колиформных бактерий, E. coli, энтерококков и Pseudomonas aeruginosa в питьевой воде с использованием тест-наборов Colilert-18, Enterolert-DW, Pseudalert или тест-наборов с аналогичными характеристиками

 

Для качественного и количественного определения колиформных бактерий, E. coli, энтерококков и Pseudomonas aeruginosa используют тест-наборы Colilert-18, Enterolert-DW, Pseudalert и тест-системы Quanti-Tray или тест-наборы с аналогичными характеристиками.

Анализ выполняют только с использованием нативной воды комнатной температуры.

При исследовании хлорированной воды во флаконы добавляют тиосульфат натрия из расчета 20 мг/л. Допускается использование стерильных одноразовых флаконов с тиосульфатом натрия. В пробах воды с чрезмерным содержанием хлора при добавлении реагентов тест-наборов может наблюдаться изменение окраски пробы, что означает негодность образца для анализа.

Не допускается предварительное обогащение пробы с использованием питательных сред, а также применение методов концентрации или растворения в ней каких-либо реагентов.

При учете результатов для сравнения используют отрицательный контроль с добавлением вместо пробы стерильной водопроводной воды с последующей инкубацией.

Для количественного определения в воде колиформных бактерий, E. coli, кишечных энтерококков и P. aeruginosa используют стерильные поддоны Quanti-Tray с 51-й лункой или с аналогичными характеристиками, по которым распределяется исследуемый образец воды с предварительно внесенной из блистера соответствующей каждому тест-набору средой, что позволяет определить от единичных до 200 клеток индикаторных бактерий в 100 см³ исследуемого образца воды, даже при наличии в указанном объеме воды миллионов гетеротрофных бактерий.

Для качественной оценки результата используют стерильные, прозрачные, бесцветные, нефлюоресцирующие флаконы.

Допускается перед анализом прогреть образец воды, помещая флакон в водяную баню температурой (36 +/- 2) °C на 20 мин или в водяную баню с температурой (44 +/- 0,5) °C на 7 - 10 мин.

Для разведения используют только стерильную дистиллированную воду.

12.1 Методы определения колиформных бактерий и E. coli в питьевой воде с использованием тест-набора Colilert-18 или тест-набора с аналогичными характеристиками

12.1.1 Качественный метод для одновременного определения колиформных бактерий и E. coli

Метод позволяет одновременно обнаружить в воде как колиформные и термотолерантные бактерии, так и E. coli.

12.1.1.1 С соблюдением правил стерильности в стерильный, прозрачный, нефлуоресцирующий флакон отбирают пробу воды в объеме 100 см³.

Во флакон к 100 см³ отобранной пробы воды добавляют содержимое одного блистера реагента Colilert-18 или с аналогичными характеристиками, надломив его верхнюю часть.

Схема внесения реагента в пробу воды представлена на рисунке 2.

После внесения реагента флакон закрывают стерильной пробкой и перемешивают до полного растворения, покачивая в течение 30 - 60 с.

 

 

Рисунок 2 - Схема внесения реагента Colilert-18 в пробу воды

 

Примечание - При добавлении реагента Colilert-18 или аналогичного во флаконе с исследуемой пробой может происходить легкое (незначительное) изменение окраски воды.

 

12.1.1.2 Для определения колиформных бактерий посевы немедленно помещают в термостат и инкубируют в течение (18 +/- 4) ч при температуре (36 +/- 2) °C.

12.1.1.3 Для определения термотолерантных колиформных бактерий посевы немедленно помещают в термостат и инкубируют в течение (18 +/- 4) ч при температуре (44 +/- 0,5) °C.

12.1.1.4 После инкубации посевов проводят учет результатов, фиксируя флаконы с желтой окраской (см. таблицу 3).

 

Таблица 3

 

Интерпретация результатов исследования питьевой воды

с помощью тест-набора Colilert-18 и тест-системы

Quanti-Tray или аналогичных

 

Цвет среды во флаконе (в лунках)	Результат
Менее желтый, чем в отрицательном контроле	Колиформные бактерии и E. coli не обнаружены
Желтый или интенсивно-желтый	Колиформные бактерии обнаружены
Желтый с положительной флуоресценцией	E. coli обнаружены

 

Отсутствие изменения цвета среды во флаконах указывает, что в исследуемом образце воды колиформные бактерии и E. coli не обнаружены.

Если образец воды имеет какой-то фоновый цвет, то необходимо сравнить цвет образца воды с растворенным реагентом Colilert-18 или с аналогичными характеристиками в такой же воде и отрицательным контролем (проинкубированная проба со стерильной дистиллированной водой, которая содержит соответствующий тестовый набор).

Изменение цвета среды на желтый подтверждает наличие колиформных бактерий в исследуемом образце воды и учитывается как положительный результат.

12.1.1.5 Флаконы с пробами, которые изменили цвет на желтый, проверяют на наличие флуоресценции, просматривая в ультрафиолетовом свете. Для просмотра в ультрафиолетовом свете используют УФ-лампу мощностью 6 Вт и длиной волны 365 нм. Образец рассматривают на расстоянии 12 - 15 см в темном помещении. Лампу держат обратной стороной к глазам лицом к образцу.

Флуоресценция среды указывает на наличие в исследуемом образце E. coli.

12.1.2 Определение наиболее вероятного числа колиформных бактерий и E. coli с помощью тест-системы Quanti-Tray и тест-набора Colilert-18 или тест-набора и тест-системы с аналогичными характеристиками

12.1.2.1 Во флакон со 100 см³ исследуемой пробы воды вносят содержимое одного блистера реагента Colilert-18 или реагента с аналогичными характеристиками и перемешивают в соответствии с 12.1.1.1.

12.1.2.2 После полного растворения реагента Colilert-18 или аналогичного в исследуемой пробе воды содержимое флакона переливают согласно инструкции в промаркированный поддон с лунками Quanti-Tray 51 или поддон с аналогичными характеристиками и запаивают в герметизаторе Quanti-Tray Sealer PLUS или герметизаторе с аналогичными характеристиками (см. рисунок 3).

 

 

Рисунок 3 - Схема подготовки поддонов с лунками Quanti-Tray

51 или поддонов с аналогичными характеристиками

для исследования воды с помощью тест-набора Colilert-18

или тест-набора с аналогичными характеристиками

 

12.1.2.3 Запаянные поддоны после герметизации высвобождают от резиновой подкладки, затем переворачивают и помещают в термостат для последующей инкубации в течение 18 - 22 ч при температуре (36 +/- 2) °C.

12.1.2.4 Для определения термотолерантных колиформных бактерий посевы помещают в термостат и инкубируют в течение 18 - 22 ч при температуре (44 +/- 0,5) °C.

12.1.2.5 После инкубации посевов проводят учет результатов, подсчитывая количество лунок в поддоне, изменивших цвет среды на желтый, и по таблице Б.1 (приложение Б) определяют наиболее вероятное число (НВЧ) колиформных бактерий.

Положительный результат для колиформных бактерий и E. coli учитывают через (18 +/- 4) ч инкубации посевов, отрицательный - через 22 ч.

Интерпретацию результатов анализа питьевой воды с помощью тест-набора Colilert-18 проводят в соответствии с таблицей 3.

12.1.2.6 После подсчета лунок с желтой окраской, указывающих на наличие колиформных бактерий, поддон просматривают в ультрафиолетовом свете для выявления E. coli согласно 12.1.1.4. При наличии голубой флуоресценции подсчитывают количество положительных лунок с флуоресценцией и определяют НВЧ E. coli по таблице Б.1 (приложение Б).

12.1.2.7 Если при подсчете результатов все лунки тест-системы Quanti-Tray 51 изменили цвет на желтый, необходимо повторно провести анализ исследуемого образца воды или его десятикратного разведения с применением стерильной дистиллированной воды или использовать системы без первоначального разбавления Quanti-Tray 2000. В этом случае при подсчете результатов следует учитывать степень разведения, умножая НВЧ, найденное по таблице, на степень разведения. При посеве предварительно разведенных проб НВЧ, найденное по таблице, умножают на коэффициент разведения. При использовании тест-системы Quanti-Tray 2000 или тест-системы с аналогичными характеристиками результат учитывают по таблице, прилагаемой к тест-системе.

12.2 Методы определения энтерококков в питьевой воде с использованием тест-набора Enterolert-DW или тест-набора с аналогичными характеристиками

12.2.1 Качественный метод для определения энтерококков

12.2.1.1 Во флакон со 100 см³ исследуемой пробы воды вносят содержимое одного блистера реагента Enterolert-DW или реагента с аналогичными характеристиками и перемешивают до полного растворения, аналогично 12.1.1.1.

12.2.1.2 Затем посевы помещают в термостат и инкубируют при температуре (41 +/- 1) °C в течение 24 - 28 ч.

12.2.1.3 После инкубации посевов проводят учет результатов, отмечая наличие изменения цвета среды согласно таблице 4.

 

Таблица 4

 

Интерпретация результатов исследования питьевой воды

с помощью тест-набора Enterolert-DW или тест-набора

с аналогичными характеристиками

 

Цвет среды во флаконе (в лунках)	Результат
Синий	Отрицательный - кишечные энтерококки не выявлены
Зеленый	Положительный - кишечные энтерококки обнаружены

 

12.2.2 Определение наиболее вероятного числа энтерококков с помощью тест-системы Quanti-Tray и тест-набора Enterolert-DW или тест-набора и тест-системы с аналогичными характеристиками

12.2.2.1 Во флакон со 100 см³ исследуемой пробы воды вносят содержимое одного блистера реагента Enterolert-DW или реагента с аналогичными характеристиками и перемешивают до полного растворения, аналогично 12.1.1.1.

12.2.2.2 Содержимое флакона переливают в соответствии с инструкцией в промаркированные поддоны с лунками Quanti-Tray или поддоны с аналогичными характеристиками, после чего запаивают в герметизаторе Quanti-Tray Sealer PLUS или герметизаторе с аналогичными характеристиками по 12.1.2.2.

12.2.2.3 Герметично запаянные поддоны инкубируют в термостате при температуре (41 +/- 1) °C в течение 24 - 28 ч. Если после 24 ч инкубации изменение цвета посевов не выявлено, то поддоны с посевами оставляют в термостате до 28 ч.

12.2.2.4 После инкубации посевов проводят учет результатов, подсчитывая количество лунок в поддоне, изменивших цвет среды с синего на зеленый (см. таблицу 4), и по таблице Б.1 (приложение Б) определяют НВЧ энтерококков.

12.3 Методы определения Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) в питьевой воде с использованием тест-набора Pseudalert или тест-набора с аналогичными характеристиками

12.3.1 Качественный метод для определения Pseudomonas aeruginosa

12.3.1.1 Во флакон со 100 см³ исследуемой пробы воды вносят содержимое одного блистера реагента Pseudalert или реагента с аналогичными характеристиками и перемешивают до полного растворения, аналогично 12.1.1.1.

12.3.1.2 Затем посевы помещают в термостат и инкубируют при температуре (36 +/- 2) °C в течение 24 - 28 ч.

12.3.1.3 После инкубации посевов проводят учет результатов с помощью УФ-лампы по 12.1.1.5, отмечая наличие голубой флуоресценции среды согласно таблице 5.

 

Таблица 5

 

Интерпретация результатов исследования питьевой воды

с помощью тест-набора Pseudalert и тест-системы

Quanti-Tray или тест-набора и тест-системы

с аналогичными характеристиками

 

Наличие или отсутствие флуоресценции	Результат
Отсутствие флуоресценции	Отрицательный - Pseudomonas aeruginosa не обнаружены
Голубая флуоресценция	Положительный - Pseudomonas aeruginosa обнаружены

 

Голубая флуоресценция среды указывает на наличие в исследуемом образце воды P. aeruginosa.

По сравнению с отрицательной контрольной пробой цвет голубой флуоресценции должен быть более интенсивным.

12.3.2 Определение наиболее вероятного числа Pseudomonas aeruginosa с помощью тест-системы Quanti-Tray и тест-набора Pseudalert или тест-набора и тест-системы с аналогичными характеристиками

12.3.2.1 Во флакон со 100 см³ исследуемой пробы воды вносят содержимое одного блистера реагента Pseudalert или реагента с аналогичными характеристиками и перемешивают до полного растворения, аналогично 12.1.1.1.

12.3.2.2 Содержимое флакона переливают, в соответствии с инструкцией, в промаркированные поддоны с лунками Quanti-Tray или поддоны с аналогичными характеристиками, после чего запаивают в герметизаторе Quanti-Tray Sealer PLUS или в герметизаторе с аналогичными характеристиками по 12.1.2.2.

12.3.2.3 Герметично запаянные поддоны инкубируют в термостате при температуре (36 +/- 2) °C в течение 24 - 28 ч. Не допускается инкубирование посевов свыше 28 ч.

12.3.2.4 После инкубации посевов поддон просматривают в ультрафиолетовом свете для выявления Pseudomonas aeruginosa согласно 12.1.1.5. При наличии голубой флуоресценции проводят учет результатов, подсчитывая количество положительных лунок с флуоресценцией (см. таблицу 5), и по таблице Б.1 (приложение Б) определяют НВЧ Pseudomonas aeruginosa.

12.4 Контроль качества питательных и дифференциальных сред и тест-наборов Colilert-18, Enterolert-DW, Pseudalert или тест-наборов с аналогичными характеристиками

12.4.1 Контроль качества питательных, дифференциальных сред и тест-наборов проводят каждой партии с учетом срока годности.

Для контроля качества питательных, дифференциальных сред и тестовых наборов рекомендуется использовать 18 - 24-часовые культуры тест-штаммов официальных национальных и международных (ATCC) коллекций микроорганизмов, выращенных на питательном агаре при температуре (36 +/- 2) °C для положительного и отрицательного контроля с типичными биохимическими свойствами, например:

- Escherichia coli 1257, Escherichia coli ATCC 25922 или Escherichia coli ATCC 11775, Klebsiella pneumoniae ATCC 31488 (положительный контроль) и Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 или Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (отрицательный контроль) при использовании тест-наборов Colilert-18 или тест-наборов с аналогичными характеристиками;

- Enterococcus faecalis или Enterococcus faecium 35667 (положительный контроль), Serratia marcescens 43862 (отрицательный контроль) при использовании тест-набора Enterolert-DW или тест-набора с аналогичными характеристиками;

- Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 или 10145 Pseudomonas fluorescens 13525 (положительный контроль), E. coli 1257 или 25922 (отрицательный контроль) при использовании тест-набора Pseudalert или тест-набора с аналогичными характеристиками.

12.4.2 Каждый из контрольных штаммов бактерий высевают на питательный агар и инкубируют в течение 18 - 28 ч при температуре (36 +/- 2) °C для получения изолированного роста колоний.

12.4.3 Контроль питательных сред проводят по наличию роста бактерий и оценке характерных свойств бактерий с проведением подтверждающих тестов.

12.4.4 После инкубации посевов бактериологической петлей снимают одну изолированную колонию и вносят в промаркированный флакон со стерильной водопроводной водой объемом 100 см³, осторожно перемешивают для получения гомогенной массы, стараясь не намочить пробку.

12.4.5 После перемешивания вносят полностью содержимое из блистера соответствующего тест-набора (Colilert-18, Enterolert DW и Pseudalert или тест-набора с аналогичными характеристиками). Дальнейшую процедуру осуществляют в соответствии с качественной оценкой исследования по 12.1.1, 12.2.1, 12.3.1 и с последующей инкубацией в течение 18 - 28 ч.

12.4.6 Результаты контроля интерпретируют в соответствии с таблицей 6.

 

Таблица 6

 

Основные параметры контроля качества тест-наборов

Colilert-18, Enterolert DW и Pseudalert или тест-наборов

с аналогичными характеристиками и учет результатов

 

Тестовые системы/определяемый показатель	Положительный контроль			Отрицательный контроль
	Тест-штаммы	Учет результатов		Тест-штаммы	Учет результатов
		Цвет	Результат		Цвет	Результат
Colilert-18/колиформные бактерии	Escherichia coli Klebsiella pneumoniae	Желтый	Обнаружены	P. aeruginosa	Цвет в лунках не изменился	Не обнаружены
Colilert-18/E. coli	Escherichia coli	Желтый с флуоресценцией	Обнаружены	P. aeruginosa или Klebsiella pneumoniae	Бесцветный или желтый без флуоресценции	Не обнаружены
Enterolert-DW/энтерококки	Enterococcus faecalis Enterococcus faecium	Зеленый	Обнаружены	Serratia marcescens	Голубой	Не обнаружены
Pseudalert/P. aeruginosa	P. aeruginosa	Голубой с флуоресценцией	Обнаружены	E. coli	Флуоресценция отсутствует	Не обнаружены

 

12.4.7 Оценку достоверности полученных результатов, а также повторяемости, воспроизводимости и правильности измерений проводят в соответствии с приложением В.