ГОСТ 34786-2021. Межгосударственный стандарт. Вода питьевая. Методы определения общего числа микроорганизмов, колиформных бактерий, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и энтерококков

10 Методы определения энтерококков в воде

 

10.1 Метод определения энтерококков с использованием мембранных фильтров

10.1.1 Отмеренный объем исследуемой воды (100 см³) фильтруют через мембранные фильтры с соблюдением требований 5.8 и 5.9. Упакованную питьевую воду, включая природную минеральную, а также воду для использования в алкогольной продукции фильтруют в объеме 250 см³. При исследовании упакованной питьевой воды, включая природную минеральную, а также воду для использования в алкогольной продукции пробы воды фильтруют в объеме 250 см³, пропуская через мембранные фильтры объемы 50, 100 и 100 см³ или 50 и 200 см³, размещая от двух до трех фильтров на одной чашке Петри с дифференциальной средой с условием, чтобы фильтры не соприкасались.

При исследовании воды неизвестного качества, если имеется предположение о внесенном загрязнении, дополнительно фильтруют 1 и 10 см³ воды, чтобы получить рост изолированных колоний.

10.1.2 После фильтрации фильтры переносят, не переворачивая, на одну из дифференциально-диагностических сред (например, среду Сланец-Бартли, энтерококковый агар Chromocult, KF Streptococcus Agar, селективную плотную питательную среду для выделения кишечных энтерококков, готовую к использованию, энтерококковый (азидный) агар, m-EI Chromogenic Agar Base, желчь-эскулиназидный агар), добиваясь полного прилегания фильтра к среде без пузырьков воздуха.

Чашки с посевами помещают в термостат дном вверх и инкубируют в течение 24 ч при температуре (36 +/- 2) °C.

При отсутствии роста колоний инкубацию посевов продолжают до 48 ч.

Для учета выбирают фильтры, на которых выросло до 50 колоний.

Подсчитывают колонии, характерные для кишечных энтерококков: выпуклые, с ровными краями, темно-малиновые (Enterococcus faecalis с биоварами) и розовые, светло-розовые, равномерно окрашенные или с темно-красным нечетко оформленным центром (Enterococcus faecium, Enterococcus durans и др.) в зависимости от используемой среды.

Очень мелкие (на пределе видимости невооруженным глазом), плоские разных оттенков, ярко-малиновые с четко выраженным центром и бесцветным ободком колонии не учитывают. Дифференциацию энтерококков от посторонней микрофлоры допускается проводить по морфологии колоний под бинокулярной лупой.

Информация о параметрах инкубации и характере роста колоний энтерококков, необходимая для учета результатов, приведена в таблице 2.

 

Таблица 2

 

Параметры инкубации и характеристика колоний фекальных

кишечных энтерококков на плотных питательных средах

 

Питательная среда	Инкубация посевов	Характер роста колоний кишечных энтерококков	Рост посторонних бактерий (не учитывают)
Среда Сланец-Бартли	При (36 +/- 2) °C, 24 - 48 ч	Темно-малиновые выпуклые с ровными краями, равномерно окрашенные (Enterococcus faecalis). Розовые равномерно окрашенные или с темно-красным центром нечетко оформленным (Enterococcus faecium)	Мелкие, плоские, ярко-малиновые с четко выраженным центром и бесцветным ободком
Энтерококковый агар Chromocult	При (36 +/- 2) °C, 24 - 48 ч	Красные, темно-бордовые, диаметром 0,5 - 2 мм и розовые	Бесцветные, сине-фиолетовые или бирюзовые колонии. Грамотрицательные бактерии не растут
KF стрептококковый агар (KF Streptococcus Agar)	При (36 +/- 2) °C, 46 - 48 ч	Красные, розовые	Оранжевые, желтые, белые. Грамотрицательные бактерии ингибируются
Основа хромогенного агара для энтерококков (m-EI Chromogenic Agar Base)	При (41 +/- 2) °C, 18 - 24 ч	Синие, при добавлении в среду ТТХ красные	Колонии другого цвета не учитывают

 

При необходимости подтверждения наличия в пробе воды энтерококков отбирают по две-три колонии каждого типа:

а) окрашивают по Граму и микроскопируют (Приложение А или см. ГОСТ 18963). При обнаружении в мазках грамположительных полиморфных, как правило, слегка вытянутых с заостренными концами диплококков, дают положительный ответ;

б) колонии пересевают секторами на солевой агар с ТТХ и инкубируют посевы в течение 24 - 48 ч при температуре (36 +/- 2) °C. Энтерококки на среде дают равномерный нежный рост на протяжении всего штриха. Другие бактерии на этой подтверждающей среде не растут;

в) выполняют каталазный тест. Для этого петлей наносят каплю дистиллированной воды на предметное стекло, в которой растирают исследуемую культуру. После подсушивания на воздухе добавляют каплю свежеприготовленной 3%-ной перекиси водорода. При отсутствии пузырьков газа считают тест каталазоотрицательным. В качестве контрольной каталазоположительной культуры используют любой вид стафилококков.

10.1.3 Для определения количества энтерококков в исследуемом объеме воды X подсчитывают число колоний кишечных энтерококков на фильтрах, где выросло менее 50 колоний, суммируют и вычисляют по формуле

 

, (4)

 

где a - число подсчитанных кишечных энтерококков в сумме;

V - объем воды, профильтрованной через фильтры, на которых проводили учет.

Результат испытаний выражают числом КОЕ энтерококков в исследуемом объеме воды.

В протоколе анализа также указывают особые обстоятельства, которые могли повлиять на результат (превышение срока хранения пробы, изменение температуры и времени инкубации посевов, отклонения от правил при учете результатов и т.д.).

При отсутствии роста колоний в протоколе анализа записывают: "КОЕ энтерококков в исследуемом объеме воды (например, 100 см³ или 250 см³) не обнаружено".

Примечание - Допускается проведение анализа в соответствии с ГОСТ ISO 7899-2.

 

10.2 Метод определения энтерококков с использованием среды Readycult Enterococci 100 или среды с аналогичными характеристиками (качественный метод)

Анализ с использованием среды Readycult Enterococci 100 или среды с аналогичными характеристиками (селективная питательная среда для определения наличия/отсутствия энтерококков и D-стрептококков в 100 см³ воды) проводят в соответствии с инструкцией производителя.

В стерильный прозрачный флакон вместимостью 250 см³ с завинчивающейся крышкой помещают 100 см³ образца воды. При хранении проб воды ниже 25 °C, в том числе в холодильнике, пробы выдерживают до посева при комнатной температуре.

Вынимают один пакет из упаковки, слегка постукивают, чтобы гранулы среды оказались на дне пакета, после чего надламывают его верхнюю часть, не дотрагиваясь до открытой части пакета, чтобы избежать внешнего загрязнения питательной среды.

Содержимое пакета добавляют во флакон к образцу воды. Закрывают флакон и перемешивают до полного растворения гранулированной среды.

Посевы инкубируют в течение 18 - 24 ч при температуре (36 +/- 2) °C.

После инкубации посевов проводят учет результатов:

- бактерии энтерококков отсутствуют, если цвет среды не изменился или отмечено помутнение среды без изменения цвета;

- энтерококки обнаружены, если цвет среды изменился.

При перемешивании цвет среды не должен изменяться. Изменение цвета среды даже в верхней части флакона также подтверждает наличие кишечных энтерококков в пробе воды (реакция с хромогенным субстратом X-GLU).