ГОСТ 34786-2021. Межгосударственный стандарт. Вода питьевая. Методы определения общего числа микроорганизмов, колиформных бактерий, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и энтерококков

9 Методы определения колиформных бактерий, общих колиформных бактерий, бактерий группы кишечной палочки, обобщенных колиформных бактерий, термотолерантных колиформных бактерий и E. coli

 

Колиформные, общие и обобщенные колиформные бактерии, БГКП, относятся к индикаторной группе бактерий, которая указывает на фекальное загрязнение воды и возможность присутствия возбудителей водоассоциированных бактериальных кишечных инфекций. В очищенной и дезинфицированной воде их обнаружение означает, что обработка была проведена некачественно или произошло вторичное микробное загрязнение.

9.1 Метод определения колиформных бактерий, общих и обобщенных колиформных бактерий, бактерий группы кишечной палочки и E. coli с использованием мембранных фильтров

9.1.1 При анализе питьевой воды системы централизованного водоснабжения высевают 300 см³ воды (три объема по 100 см³), пропуская этот объем не менее чем через два мембранных фильтра. При получении стабильных отрицательных результатов фильтрация 300 см³ воды допустима через один фильтр. При исследовании воды неизвестной степени бактериального загрязнения следует засевать несколько объемов, например, 10, 40, 100, 150 см³ воды.

При исследовании питьевой воды нецентрализованного водоснабжения анализируют объем пробы воды не менее 100 см³, пропуская через мембранные фильтры объемы 10 и 100 см³, размещая от двух до четырех фильтров (в зависимости от диаметра фильтров и чашки Петри) на одной чашке Петри с дифференциальной средой с условием, чтобы фильтры не соприкасались.

При исследовании упакованной питьевой воды, включая природную минеральную, а также воду для использования в алкогольной продукции, анализируют объем пробы воды 250 см³, пропуская через мембранные фильтры объемы 50, 100 и 100 или 50 и 200 см³, размещая от двух до четырех фильтров на одной чашке Петри с дифференциальной средой с условием, чтобы фильтры не соприкасались.

При фильтровании воды неизвестного качества увеличивают количество фильтруемых объемов для получения изолированных колоний (например, выполняя посев по 1 см³ из 1-го и 2-го десятикратных разведений). Фильтрующее устройство и мембранные фильтры стерилизуют по 5.8 и 5.9.

Следует начинать с фильтрования проб обеззараженной воды или тех проб, которые предположительно не загрязнены, а затем фильтровать загрязненные пробы.

При фильтровании объема исследуемой воды 1 см³ необходимо в воронку предварительно налить не менее 10 см³ стерильной водопроводной воды, а затем внести анализируемую воду с последующим созданием вакуума.

Если вода для исследования с повышенной мутностью, фильтрация больших объемов затруднена, то засевают объемы воды 0,1 см³ и 0,1 см³ из разведений засевают прямым посевом на чашки с дифференциально-диагностической средой с последующим растиранием посевов шпателем до полного впитывания влаги в среду.

9.1.2 После фильтрования анализируемой воды мембранные фильтры размещают посевом вверх на одну из селективных дифференциальных сред, например на среду Эндо, среду с тергитолом 7 или другие альтернативные селективные дифференциальные среды, разлитые в чашки Петри, добиваясь полного прилегания фильтров к толще среды, исключая образование пузырьков воздуха.

Примечание - Перед посевом чашки с селективными дифференциальными средами рекомендуется помещать на 10 - 15 мин в термостат при (44 +/- 0,5) °C для прогревания и удаления с поверхности среды влаги.

 

Лактозный агар с тергитолом 7 используют вместо среды Эндо при исследовании воды с небольшим числом бактерий, при условии, что взвешенные вещества и фоновая микрофлора не оказывают отрицательного влияния на фильтрацию, культивирование и учет бактерий. Среда обладает низкой селективностью, поэтому она пригодна для обнаружения поврежденных и стрессированных клеток бактерий, в том числе с замедленной ферментацией лактозы.

На одну чашку с дифференциальной средой допускается помещать от двух до четырех фильтров (в зависимости от диаметра фильтров и чашки Петри) с условием, чтобы фильтры не соприкасались. Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, номера пробы и даты посева. Чашки с посевами помещают в термостат дном вверх и инкубируют при температуре (36 +/- 2) °C в течение (24 +/- 3) ч.

9.1.3 При отсутствии роста каких-либо колоний на фильтрах или при наличии только пленчатых, губчатых, с неровной поверхностью и краями, плесневых и других нехарактерных для колиформных бактерий колоний выдают отрицательный результат.

При обнаружении колоний, характерных для бактерий семейства Enterobacteriaceae (БГКП), колиформных, общих или обобщенных колиформных бактерий выполняют оксидазный тест путем наложения фильтра колониями вверх на кружок фильтровальной бумаги, обильно смоченный оксидазным реактивом, в соответствии с А.1 и А.2 (приложение А). При прямом посеве оксидазный тест выполняют в соответствии с А.3 (приложение А).

Колонии, изменившие цвет на синий или сине-фиолетовый, из учета исключают.

Если все колонии изменили цвет, выдают отрицательный ответ.

Среди колоний, не изменивших цвет, подсчитывают отдельно колонии каждого типа.

На среде Эндо подсчитывают типичные колонии: красные, темно-красные с металлическим блеском и без него, с отпечатком на обратной стороне фильтра (лактозоположительные), розовые разных оттенков (лактозоотрицательные).

По три-четыре колонии каждого типа пересевают в пробирки с полужидкой средой Гисса с глюкозой для подтверждения их принадлежности к колиформным, обобщенным или общим колиформным бактериям, бактериям семейства Enterobacteriaceae. Посевы инкубируют при температуре (36 +/- 2) °C в течение (24 +/- 3) ч. Первичный учет на подтверждающих полужидких средах возможен через 4 - 6 ч. При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ. При отсутствии кислоты и газа или при наличии только кислоты для окончательного учета пробирки с посевами оставляют в термостате до 48 ч.

На среде с тергитолом 7 подсчитывают типичные колонии с желто-оранжевой, кирпично-красной окраской, иногда с ржаво-окрашенным центром, образующим желтую окраску в среде под мембраной.

9.1.4 Если на фильтрах на дифференциально-диагностических средах выросли типичные лактозоположительные грамотрицательные, в соответствии с А.4 (приложение А) колонии с отрицательным оксидазным тестом, проведенным в соответствии с А.1 и А.2 (приложение А), их число суммируют, умножают на 100 и делят на профильтрованный объем. В протоколе анализа указывают количество колиформных и общих колиформных бактерий, выросших в 100 см³ воды.

Для определения бактерий E. coli типичные колонии на среде Эндо (темно-красные с металлическим блеском и отпечатком) или желтые на среде с тергитолом 7 пересевают на среды с лактозой (в лактозный бульон с борной кислотой с ватой или поплавком для улавливания газа, лактозо-пептонную среду с поплавком) и немедленно помещают в термостат при (44 +/- 0,5) °C. Среды перед посевом должны быть прогреты до температуры 44 °C - 45 °C. В качестве E. coli учитывают колонии, дающие помутнение и газообразование через (24 +/- 2) ч инкубации посевов.

Примечание - Для приготовления лактозного бульона с борной кислотой в 1 л дистиллированной воды растворяют: 10 г пептона, 12,2 г калия фосфорнокислого двузамещенного (безводного), 4,1 г калия фосфорно-кислого однозамещенного (безводного), 3,2 г борной кислоты, 5 г лактозы. После растворения всех ингредиентов при нагревании среду остужают до комнатной температуры и разливают по 5 мл в пробирки с поплавками или комочками ваты, стерилизуют при (112 +/- 2) °C 12 мин. Срок хранения - не более двух недель. Каждую новую партию борной кислоты следует испытывать. При выращивании E. coli при температуре (44 +/- 2) °C среда дает положительную реакцию - помутнение и газ.

 

Если на фильтрах выросли лактозоотрицательные колонии с отрицательным оксидазным тестом, то такие колонии пересевают в полужидкую среду с глюкозой и инкубируют посевы при (36 +/- 2) °C. Учет образования кислоты и газа проводят через 4 - 6 ч, при отсутствии газа пробирки оставляют в термостате до 24 ч для окончательного учета. Число бактерий, ферментирующих глюкозу до кислоты и газа, суммируют с числом лактозоположительных колоний, сумму делят на профильтрованный объем. В протоколе анализа указывают число обобщенных колиформных бактерий, БГКП, выросших в исследуемом объеме воды.

Если при выборочной проверке колоний одного типа получены неодинаковые результаты, то вычисляют число подтвержденных бактерий одного типа X по формуле

 

X = (a·c)/b, (2)

 

где a - общее число колоний этого типа;

b - число проверенных из них;

c - число колоний с положительным результатом.

Подсчитывают число подтвержденных колоний каждой группы отдельно. Подсчет ведут только на тех фильтрах, где обнаружены изолированные колонии. Результат подсчета на каждом фильтре суммируют и определяют число КОЕ в исследуемом объеме воды Y по формуле

 

Y = (a·M)/V, (3)

 

где Y - сумма подтвержденных колоний в исследованном объеме;

M - нормируемый объем воды;

V - объем воды, профильтрованный через фильтры, на которых проводили учет.

При получении дробного ответа в протоколе исследования рекомендуется результат округлять в большую сторону.

Анализ воды заканчивают через 18 - 24 ч.

Окончательный результат указывают в протоколе анализа: "Число КОЕ колиформных бактерий в исследуемом объеме" или "Число КОЕ наименование бактерий, определяемых в соответствии с 3.7 - 3.8 в исследуемом объеме" или "Число КОЕ БГКП в исследуемом объеме" или "Колиформные бактерии в исследуемом объеме не обнаружены" или "Наименование бактерий, определяемых в соответствии с 3.7 - 3.8, в исследуемом объеме не обнаружены", или "БГКП в исследуемом объеме не обнаружены" и регистрируют в журнале испытаний.

В случаях сплошного роста на всех фильтрах и невозможности учета результатов анализа в протоколе записывают: "Сплошной рост" и анализ повторяют.

Примечание - При обнаружении оксидазоположительных колоний рекомендуется провести отсев подозрительных колоний для проведения дальнейшей идентификации и их принадлежности к P. aeruginosa.

 

Примеры

1 При посеве трех фильтров, через которые было профильтровано по 100 см³ образца воды, при учете результатов обнаружено, что на одном фильтре выросло две колонии в 100 см³, на остальных фильтрах рост не отмечен (отсутствует). Число бактерий рассчитывают следующим образом:

(2·100) : 300 = 0,7 КОЕ колиформных бактерий в 100 см³.

При этом в протоколе исследования результат записывают, проводя округление до целых чисел в сторону увеличения: "1 КОЕ колиформных бактерий в 100 см³" либо "0,7 КОЕ колиформных бактерий в 100 см³".

2 При посеве 10, 40, 100, 150 см³ на фильтрах с профильтрованным объемом 40 см³ выросло четыре изолированных колонии, с профильтрованным объемом 100 см³ - три колиформные бактерии. Фильтры с объемом 10 и 150 см³ заросли и учету не подлежат. Суммируют общее число колоний на тех фильтрах, где получены изолированные колонии, и пересчитывают на объем 100 см³:

(4 + 3)·100 : (40 + 100) = 5 КОЕ в 100 см³.

При этом в протоколе исследования результат записывают "5 КОЕ колиформных бактерий в 100 см³".

9.2 Метод определения E. coli с использованием мембранных фильтров

Для обнаружения E. coli допускается проведение дополнительного посева исследуемой воды на фильтре объемом 100 см³ на дифференциальные лактозные среды с дальнейшей инкубацией посева микроорганизмов при температуре (44 +/- 0,5) °C.

Если на мембранном фильтре в течение 18 - 24 ч не обнаружен рост колоний или выросли нетипичные колонии, то в журнале испытаний регистрируют сведения об отсутствии E. coli в пробе воды.

При наличии выросших на мембранных фильтрах характерных темно-красных колоний с металлическим блеском и отпечатком проводят их дальнейшее подтверждение на принадлежность к бактериям E. coli в соответствии с 9.1.4.

Подтверждением наличия E. coli является помутнение и газообразование в среде лактоза с борной кислотой. Подтвержденные колонии подсчитывают.

Результат испытаний выражают числом КОЕ E. coli в 100 см³ воды.

При фильтрации пробы объемом более 100 см³ или нескольких объемов пробы воды на разных мембранных фильтрах результат испытаний вычисляют по 9.1.4.

При отсутствии на фильтрах роста характерных для E. coli колоний и отрицательной реакции на подтверждающих средах в протоколе испытаний записывают: "КОЕ в 100 см³ воды не обнаружены".

При необходимости получения количественной оценки результата определения E. coli в анализируемой пробе воды подсчитывают сумму всех подтвержденных колоний в соответствии с 9.1.4.

Примечание - Допускается проведение анализа в соответствии с ГОСТ 31955.1.

 

9.3 Определение термотолерантных колиформных бактерий

Для определения термотолерантных колиформных бактерий работают с секторами среды Эндо, где выросли типичные лактозоположительные колонии. Делают посев двух-трех изолированных колоний каждого типа с каждого сектора в пробирки с любой из лактозных сред.

Среду перед посевом нагревают на водяной бане или в термостате до (44 +/- 0,5) °C. Немедленно после посева пробирки помещают в термостат и инкубируют при температуре (44 +/- 0,5) °C в течение 18 - 24 ч. Допускается просмотр посевов через 4 - 6 ч.

При росте на среде Эндо лактозоположительных бактерий и выявлении способности этих бактерий ферментировать лактозу до кислоты и газа в течение 18 - 24 ч при температуре (44 +/- 0,5) °C дают положительный ответ на наличие в этом объеме пробы воды ТКБ.

Результат испытаний выражают числом КОЕ ТКБ в исследуемом объеме воды по 9.2.

При отсутствии на фильтрах роста ТКБ в протоколе испытаний записывают: "КОЕ ТКБ в исследуемом объеме воды не обнаружены".

9.4 Определение колиформных бактерий, общих колиформных бактерий, бактерий группы кишечной палочки и E. coli методом мембранной фильтрации с использованием хромогенных питательных сред

Определение колиформных бактерий и E. coli в пробе анализируемой воды проводят с использованием мембранной фильтрации, применяя в качестве питательной среды одну из хромогенных сред (например, Chromocult Coliform Agar или аналога).

После фильтрации пробы воды фильтр помещают на поверхность хромогенной среды.

Инкубацию посевов проводят при температуре (36 +/- 2) °C в течение 21 - 24 ч.

По истечении времени инкубации посевов, с учетом результата оксидазного теста, подсчитывают количество окрашенных колоний, выросших на фильтре, характерных для колиформных бактерий: колонии от красного цвета до оранжевого, бесцветные, розовые (реакция с Salmon-GAL), включая E. coli: от темно-синего до фиолетового цвета (реакция с Salmon-GAL и X-глюкуронидом). Мелкие колонии не учитывают.

Обработку и оформление результатов проводят по формуле (3) в соответствии с 9.1.4.

9.5 Определение E. coli методом мембранной фильтрации с использованием среды с желчью.

Для определения E. coli используют две среды: триптон-желчный агар (ТЖА) и триптон-соевый агар (ТСА).

Фильтрование отмеренных объемов воды проводят по 5.9.

После фильтрования отмеренных объемов воды мембранные фильтры с посевами помещают на ТСА и инкубируют в термостате при температуре (36 +/- 2) °C в течение 4 - 5 ч.

Затем фильтры переносят на ТЖА и продолжают инкубацию посевов при температуре (44 +/- 0,5) °C в течение 19 - 20 ч.

После инкубации посевов учитывают наличие или отсутствие на фильтрах роста колоний.

При росте на фильтрах изолированных колоний белого, палевого, кремового цвета мембранный фильтр помещают на фильтровальную бумагу, смоченную реактивом для индольного теста (реактив Ковача) и облучают ультрафиолетовой лампой в течение 10 - 30 мин в зависимости от скорости окрашивания.

Все колонии микроорганизмов красного цвета на мембранном фильтре учитывают как колонии E. coli и подсчитывают их число.

Использование реактива Ковача на водной основе (для ускоренного индольного теста) дает более четкие и быстрые результаты без применения ультрафиолетового облучения.

Неравномерное распределение колоний микроорганизмов на фильтре или обильный рост сопутствующих микроорганизмов могут мешать идентификации колоний микроорганизмов с положительной реакцией на образование индола из-за диффузии окраски в прилегающие колонии микроорганизмов.

Обработку результатов проводят по 9.1.1 аналогично обработке результатов по определению колиформных бактерий.

Результат испытаний выражают числом КОЕ бактерий E. coli в 100 см³ анализируемой пробы воды.

При отсутствии роста колоний E. coli на фильтрах или наличии отрицательной реакции на образование индола (отсутствие изменения цвета колоний) в протоколе испытаний записывают: "E. coli КОЕ/100 см³ воды не обнаружены".

9.6 Метод определения колиформных бактерий и E. coli с использованием тест-систем с готовыми питательными средами на подложке

Петрифильм тест-системы с готовыми питательными средами на подложке или с аналогичными характеристиками (далее - тест-системы) для определения колиформных бактерий и E. coli готовят к анализу в соответствии с инструкцией производителя с соблюдением правил стерильности.

Сначала проводят фильтрацию проб воды с помощью мембранных фильтров по 5.9.

После фильтрации фильтры стерильным пинцетом помещают на подложку. Посевы инкубируют в термостате при температуре (36 +/- 2) °C в течение 18 - 24 ч.

Колиформные бактерии в зависимости от использованной тест-системы определяют по следующим признакам: характерному цвету колоний, изменению цвета среды вокруг колоний. Наличие газообразования под пленкой тест-систем также подтверждает присутствие в пробе воды колиформных бактерий.

Для определения E. coli при использовании тест-систем одновременно с ростом бактерий учитывают газообразование и характерную окраску колоний, что исключает дополнительный этап их идентификации.

Расчет и оформление результатов проводят по формуле (2) в соответствии с 9.1.4.

9.7 Метод определения колиформных бактерий и бактерий E. coli с использованием среды Readycult Coliforms 100 или с аналогичными характеристиками (качественный метод)

9.7.1 Анализ с использованием среды Readycult Coliforms 100 или с аналогичными характеристиками (селективная питательная среда для определения наличия/отсутствия колиформных бактерий и E. coli в 100 см³ воды) проводят в соответствии с инструкцией производителя.

При хранении проб воды при температуре ниже 25 °C исследование следует начать не позднее чем через 6 ч после отбора проб. Пробы воды хранят не более 24 ч в холодильнике при температуре от 2 °C до 8 °C, при этом посев начинают после нагревания пробы до комнатной температуры, но не позднее чем через 6 ч.

В стерильный прозрачный флакон вместимостью 250 см³ с завинчивающейся крышкой помещают 100 см³ образца воды.

Вынимают один пакет из упаковки, слегка постучав, чтобы гранулы среды оказались на дне пакета, после чего надламывают его верхнюю часть, не дотрагиваясь до открытой части пакета, чтобы избежать внешнего загрязнения питательной среды.

Содержимое пакета добавляют во флакон к образцу воды. Закрывают флакон и перемешивают до полного растворения гранулированной среды.

Посевы инкубируют в течение 18 - 24 ч при температуре (36 +/- 2) °C.

После инкубации посевов проводят учет результатов:

- колиформные бактерии и E. coli отсутствуют, если цвет среды не изменился или отмечено помутнение без изменения цвета среды;

- бактерии обнаружены, если среда приобрела зелено-голубой цвет во всем объеме или верхнем слое. При перемешивании цвет среды не должен изменяться.

Для подтверждения наличия E. coli в емкостях, в которых отмечено изменение цвета среды, вносят 2,5 см³ реактива Ковача. Красное кольцо на поверхности среды подтверждает образование индола, что свидетельствует о наличии E. coli в исследуемой пробе воды. Наличие E. coli допускается подтверждать также по свечению содержимого емкости в УФ-свете при использовании УФ-лампы (при наличии флуорогенного субстрата в составе среды).

Изменение цвета среды Readycult Coliforms 100 или с аналогичными характеристиками при определении наличия/отсутствия колиформных бактерий и E. coli в 100 см³ воды представлено на рисунке 1 и в таблице 1.

 

 

а) Контрастное изменение цвета среды - колиформы обнаружены

 

 

б) Цвет среды не изменился - отрицательный

результат - колиформы и E. coli отсутствуют

 

 

в) Наличие свечения (флюоресценция)

в УФ-свете - E. coli обнаружены

 

 

г) Вишнево-красное кольцо (положительный тест

на индол) - E. coli обнаружены

 

Рисунок 1 - Изменение цвета среды Readycult Coliforms 100

или с аналогичными характеристиками при определении

наличия/отсутствия колиформных бактерий и E. coli

в 100 см³ воды

 

Таблица 1

 

Признаки наличия/отсутствия колиформных бактерий и E. coli

при использовании среды Readycult Coliforms 100

или с аналогичными характеристиками

 

Наличие/отсутствие показателя	Изменение цвета среды на сине-зеленый (наличие/отсутствие)	Флюоресценция	Индольный тест
Наличие колиформных бактерий	+	-	-
Наличие E. coli	+	+	+
Отсутствие E. coli и колиформных бактерий	Светло-желтый	-	-
Примечание - "+" - положительный результат; "-" - отрицательный результат.

 

9.7.2 При изменении цвета среды в протокол учета результатов записывают: "колиформные бактерии обнаружены в 100 см³ воды", при изменении цвета среды и флюоресценции: "E. coli обнаружены в 100 см³ воды", если цвет среды не изменился: "колиформные бактерии в 100 см³ в воде не обнаружены" или и "E. coli в 100 см³ воды не обнаружены".

Примечание - Применение аналогичных сред для определения колиформных бактерий и бактерий E. coli необходимо только в соответствии с инструкцией производителя к ним.