ГОСТ 34786-2021. Межгосударственный стандарт. Вода питьевая. Методы определения общего числа микроорганизмов, колиформных бактерий, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и энтерококков

8 Экспресс-методы определения общего числа микробных клеток при их прямом микроскопическом подсчете

 

8.1 Метод Разумова

8.1.1 Сущность метода заключается в концентрировании микроорганизмов из воды на мембранном фильтре, окрашивании их красителем непосредственно на фильтре, приготовлении препарата для микроскопирования и подсчитывании под микроскопом с помощью окулярного сетчатого микрометра в нескольких полях зрения на определенной площади препарата.

Метод применяют в экстренных случаях, когда необходимо срочно дать ответ о количественном содержании бактерий, например при авариях в системе водоснабжения и т.п.

8.1.2 Отмеренный объем исследуемой пробы воды фильтруют через мембранные фильтры с размером пор 0,15 - 0,25 мкм.

Примечание - Не рекомендуется использовать фильтры фирмы MILLIPOR (США) ввиду специфичности их волокнистой структуры, так как бактериальные клетки не оседают на поверхности фильтра, а "проваливаются" в его толщу, что делает невозможным их микроскопирование.

 

Фильтры с осевшими на них микроорганизмами помещают на фильтровальную бумагу в чашках Петри и высушивают на воздухе. Для ускорения процесса высушивания фильтры допускается помещать в термостат или слабо нагретый сушильный шкаф.

8.1.3 Высушенные фильтры накладывают нижней стороной на фильтровальную бумагу, предварительно смоченную раствором карболового эритрозина, помещенную в чашку Петри, и закрывают крышкой.

Примечание - Раствор карболового эритрозина готовят следующим образом: 5 г эритрозина растворяют в 100 см³ 5%-ного раствора фенола.

 

Для окрашивания фильтры выдерживают не менее 1 ч (в среднем время окрашивания составляет 3 - 5 ч). Для равномерного окрашивания клеток мембранный фильтр должен плотно прилегать к бумажному фильтру с эритрозином.

8.1.4 Затем мембранный фильтр отмывают от красителя, перекладывая его на фильтровальной бумаге, обильно смоченной дистиллированной водой, до тех пор, пока вода не перестанет окрашиваться. После последней промывки поверхность фильтра остается розовой (за счет окрашенных бактерий), а края его становятся бледно-розовыми.

После этого мембранный фильтр с окрашенными микроорганизмами высушивают на воздухе.

Примечания

1 Для более эффективного окрашивания бактерий на фильтре рекомендуется использовать фуксин Циля, разведенный в 600 раз дистиллированной водой.

2 Окончательное окрашивание рекомендуется проводить свежеприготовленным фуксином Пфейффера или 1%-ным водным раствором метиленового синего, после чего отмытый фильтр докрашивают фуксином Пфейффера. Время докрашивания составляет от 5 мин до 1 ч. Эта модификация усиливает окраску клеточных элементов, увеличивает контрастность препарата, что значительно облегчает количественный учет бактерий на мембранном фильтре.

 

8.1.5 Готовят препарат для микроскопирования. Для этого на обезжиренное предметное стекло наносят каплю иммерсионного масла, помещают на него окрашенный мембранный фильтр с осевшими клетками микроорганизмов верхней стороной, а сверху наносят другую каплю иммерсионного масла и накрывают покровным стеклом, исключая пузырьки воздуха.

8.1.6 Готовый препарат микроскопируют с иммерсионным объективом при увеличении 90^x или 100^x, в окуляр вкладывают сетчатый микрометр 10^x, разделенный на мелкие квадраты.

Микроорганизмы подсчитывают в 20 полях зрения (в каждом поле зрения в четырех маленьких квадратах, расположенных по диагонали).

В каждом квадрате для достоверного счета должно содержаться 10 - 30 клеток бактерий. Более плотное распределение бактерий недопустимо.

8.1.7 Общее количество микроорганизмов в 1 см³ воды X вычисляют по формуле

 

X = S·N·10⁶/S₁·V, (1)

 

где S - фильтрующая площадь аппарата, мм²;

N - среднее число микроорганизмов в одном квадрате;

S₁ - площадь квадрата окулярного сетчатого микрометра, мкм²;

V - объем профильтрованной воды, см³;

10⁶ - коэффициент перевода в мкм (мм² в мкм²).

Примечание - Отношение S·N·10⁶/S₁ - постоянная величина для данного микроскопа, одного и того же фильтровального аппарата, при пользовании одинаковым окуляром, объективом и сеткой.

 

8.2 Метод фазово-контрастной микроскопии подсчета общего числа микробных клеток на мембранном фильтре

После фильтрации воды и последующего высушивания мембранного фильтра готовят препарат методом Разумова по 8.1.5 и подсчитывают бактерии под микроскопом с помощью фазового-контрастного устройства, используя зеленый светофильтр, благодаря которому получается поле зрения спокойного зеленого цвета.

Бактерии выглядят как черные точки или палочки различных размеров. Анализ занимает 15 - 20 мин. Данный метод ускоряет и упрощает анализ, исключая необходимость окраски бактерий.

8.3 Люминесцентный метод подсчета общего числа микробных клеток на мембранном фильтре

8.3.1 Люминесцентно-микроскопический метод позволяет через 30 мин получить ответ о количественном содержании в воде как общего числа бактериальных клеток, так и отдельно количества живых и мертвых бактерий.

8.3.2 Для проведения анализа используют нелюминесцирующие мембранные фильтры.

С целью исключения люминесценции мембранных фильтров перед окрашиванием их освобождают от наполнителя путем кипячения в дистиллированной воде, сменяя воду до исчезновения специфического запаха.

Затем мембранные фильтры по одному опускают в горячий 0,5%-ный раствор красителя Бисмарк коричневый и кипятят при помешивании в течение 30 мин.

По окончании окрашивания фильтры промывают под струей водопроводной воды, а избыток красителя из них удаляют путем кипячения фильтров в дистиллированной воде при периодической смене ее до тех пор, пока сливаемая вода не станет бесцветной.

Готовые фильтры высушивают на фильтровальной бумаге и хранят в черной фотографической бумаге.

8.3.3 Перед фильтрованием исследуемых проб воды мембранные фильтры, подготовленные по 8.3.2, смачивают в горячей дистиллированной воде. В воронку фильтровального аппарата сначала вносят 10 см³ стерильной дистиллированной воды, а затем анализируемую воду.

После фильтрации мембранный фильтр с осевшими на нем бактериями подсушивают на стерильной фильтровальной бумаге до полного высыхания.

8.4 Люминесцентный метод подсчета общего числа микробных клеток на мембранном фильтре с применением акридинового оранжевого

8.4.1 Сущность метода по 8.3 заключается в концентрировании микроорганизмов из воды на нелюминесцирующем мембранном фильтре, с последующим флуорохромированием акридиновым оранжевым, приготовлением препарата для микроскопирования и раздельного подсчета под люминесцентным микроскопом числа живых (зеленых) и мертвых (красных) клеток.

8.4.2 Через люминесцирующий мембранный фильтр фильтруют объем исследуемой воды, чтобы в одном квадрате сетчатого микрометра было 10 - 20 клеток.

После фильтрации мембранный фильтр, не высушивая, переносят на поверхность фильтровальной бумаги, смоченной раствором флуорохрома, осевшими бактериями вверх на 15 - 20 мин.

Примечание - В качестве раствора флуорохрома применяют акридиновый оранжевый. Раствор акридинового оранжевого готовят непосредственно перед определением на фосфатном буферном растворе (pH 6,0) в разведении 1:2000.

 

Затем фильтр отмывают от остатков флуорохрома перекладыванием на влажной фильтровальной бумаге до тех пор, пока площадка под фильтром не перестает окрашиваться, высушивают на воздухе или в термостате и готовят препарат для микроскопирования, используя нелюминесцирующее масло (например, парафиновое или вазелиновое).

После высушивания фильтр помещают на предметное стекло между слоями парафинового или вазелинового масла, накрывают покровным стеклом и осуществляют подсчет бактерий под люминесцентным микроскопом в падающем свете со светофильтрами СЗС-14, БС-8 и ФС-1, с запирающим светофильтром ЖС-18. Подсчитывают с помощью окулярного микрометра общее число бактерий, не менее чем в 20 квадратах, среди которых подсчитывают число зеленых (живых) и красных (мертвых) бактериальных клеток.

8.4.3 Для расчета используют формулу (1) (см. 8.1.7). Учитывая быстрое выцветание препарата, необходимо быстро проводить подсчет, а для подсчета каждого следующего квадрата обязательно передвигать препарат на еще не облученный участок.

8.4.4 При необходимости допускается высушенный фильтр после фильтрации воды хранить длительное время в черной бумаге.