ГОСТ 34786-2021. Межгосударственный стандарт. Вода питьевая. Методы определения общего числа микроорганизмов, колиформных бактерий, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и энтерококков

7 Методы определения общего микробного числа

 

7.1 Определение общего микробного числа при посеве в агаризированную среду

7.1.1 Сущность метода заключается в определении в 1 см³ воды общего содержания мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов, способных образовывать на питательном агаре колонии, видимые при увеличении в два раза после инкубации при температуре (36 +/- 2) °C или при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 +/- 2 ч, а при отсутствии роста учет допустимо проводить через 48 ч и инкубации при температуре (22 +/- 2) °C в течение (72 +/- 2) ч для учета сапрофитных водных микроорганизмов.

Примечание - Для оценки антропогенного микробного загрязнения, вторичного загрязнения, условий хранения воды определяют ОМЧ при (36 +/- 2) °C и (22 +/- 2) °C.

 

7.1.2 Перед проведением анализа каждую пробу воды тщательно перемешивают.

Питательный агар расплавляют, охлаждают до температуры 45 °C - 50 °C и помещают до использования в водяную баню при температуре (48 +/- 1) °C для поддержания температурного режима питательного агара. Расплавленный агар используют в течение одного рабочего дня. Он не подлежит хранению и повторному расплавлению.

Пробы воды объемом по 1 см³ засевают в две чашки Петри глубинным методом. При исследовании воды неизвестного качества возможно проведение дополнительного посева на две чашки по 1 см³ из десятикратного разведения.

Примечание - Если визуально вода, поступившая на исследование, не соответствует органолептическим показателям цветности и мутности или рядом с местом отбора находится источник фекального загрязнения, пробы воды разводят в соответствии с 5.11 и засевают по чашке из каждого разведения.

 

7.1.3 С соблюдением правил асептики отбирают соответствующие объемы проб воды и вносят в стерильные чашки, слегка приоткрывая крышку.

После внесения исследуемой воды в чашки Петри ее заливают слоем питательного агара (для чашки Петри диаметром 90 мм заливают 8 - 12 мл расплавленного агара) при фламбировании краев емкости, в которой он содержался, так чтобы слой питательного агара был тонким и составлял 2 - 3 мм.

Воду быстро смешивают с агаром, осторожно наклоняя или вращая чашку по поверхности стола, исключая образования пузырьков воздуха и не покрытых агаром частей дна чашки, а также попадания агара на края и крышку чашки. После этого чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания питательного агара в течение 20 мин.

После застывания агара чашки переворачивают вверх дном, помещают в термостат не более чем по три-четыре чашки в стопке и инкубируют при температуре (36 +/- 2) °C в течение (24 +/- 2) ч. При определении ОМЧ при 22 °C инкубацию проводят при температуре (22 +/- 2) °C в течение (72 +/- 2) ч.

7.1.4 После инкубации подсчитывают все выросшие на чашках колонии. При учете результатов оценивают все объемы посевов, в которых можно подсчитать количество выросших колоний. Чашки с ползучим ростом бактерий, распространившихся на всю поверхность чашки или на значительные зоны, маскирующие рост других колоний, исключают. Подсчитанное число колоний на каждой чашке суммируют, пересчитывают на объем воды, засеянный на эти чашки, к объему в 1 см³. Подсчитывают среднеарифметическое число колоний, выросших на чашках, на которых вели учет, и делят на количество чашек, учитываемых при расчете среднеарифметического результата. Учету подлежат чашки, на которых наблюдается рост отдельных колоний.

Результат выражают либо дробным числом, либо целым числом КОЕ в 1 см³. Для выдачи результата в виде целого числа полученный результат округляют в сторону увеличения.

Допускается представлять результат на основании подсчета колоний на одной чашке (с отметкой в протоколе анализа) в случаях, если на других чашках рост расплывчатых колоний распространился на всю поверхность чашки.

В протоколе анализа результаты определения ОМЧ записывают следующим образом: "Число КОЕ/см³" воды с указанием температуры инкубации посевов. Если рост колоний на чашках отсутствует, в протоколе исследований записывают: в графе определяемые показатели "ОМЧ", в графе единицы измерения в исследуемом объеме "КОЕ/см³", в графе результаты "ноль".

Примечание - Если на всех чашках имеет место рост расплывчатых колоний, не распространившийся на всю поверхность, или выросло более 300 колоний и анализ повторить невозможно, если рост расплывчатых колоний распространился на всю поверхность чашки или подсчет невозможен из-за массивного роста, то подсчитывают сектор чашки с последующим пересчетом на всю поверхность и в протоколе исследования в графе результаты записывают "более 300 КОЕ/см³", в этих случаях целесообразно повторить анализ воды. Результат может быть выражен в соответствии с требованиями документов, действующих на территории государства, принявшего настоящий стандарт.

 

Воспроизводимость результатов метода может быть достигнута при строгом соблюдении условий проведения анализа, а также при использовании питательного агара одинакового состава.

Примечание - Допускается проведение анализа в соответствии с ГОСТ ISO 6222.

 

7.2 Определение общего микробного числа с использованием мембранных фильтров

7.2.1 Сущность метода заключается в концентрировании микроорганизмов из определенного объема анализируемой воды на мембранном фильтре, выращивании их при (36 +/- 2) °C на питательном агаре и подсчете количества микроорганизмов в 1 см³ воды.

7.2.2 Фильтрацию выполняют с использованием прибора для фильтрования воды в соответствии с 5.9. Допускается проводить фильтрование путем помещения стерильного мембранного фильтра на подкладку из нескольких слоев фильтровальной бумаги в стерильные чашки Петри. Отмеренный объем воды при помощи пипетки постепенно и равномерно наносят на поверхность мембранного фильтра, фильтровальная бумага впитывает воду, прошедшую через мембранный фильтр.

7.2.3 Затем мембранный фильтр стерильным пинцетом перекладывают на чашку Петри с питательным агаром. Переворачивают чашку вверх дном и инкубируют посевы при (36 +/- 2) °C в течение 24 ч. Для облегчения подсчета колоний и получения более точного результата используют реактив тетраметил-п-фенилендиамин гидрохлорид для определения оксидазной активности.

После инкубации посевов мембранные фильтры переносят на фильтровальную бумагу, смоченную оксидазным реактивом. Колонии бактерий, обладающих оксидазной активностью, окрашиваются в яркий сине-фиолетовый цвет. При этом даже самые мелкие колонии хорошо видны на фоне светлого фильтра. Эта группа представлена бактериями рода Pseudomonas, Aeromonas, Vibrio - активные участники самоочищения воды водоемов. Оксидазоотрицательные бактерии также хорошо различимы на фоне слегка посиневшего фильтра. Метод позволяет всего за 1 - 5 мин дать качественную и количественную характеристику различных групп сапрофитных бактерий.

7.2.4 Учитывают общее число выросших колоний с последующим пересчетом на 1 см³ анализируемой воды. Результат выражают числом КОЕ в 1 см³ воды.

7.3 Определение общего микробного числа с использованием петрифильмов - тест-систем с готовыми питательными средами на подложке

7.3.1 Для реализации метода используются тест-системы с готовыми сухими питательными средами на подложке петрифильмы (Petrifilm) или с аналогичными характеристиками (далее тест-системы), содержащие готовую питательную среду и гель, растворимый в холодной воде, который застывает при комнатной температуре. На поверхность наносят сетку, которая облегчает подсчет колоний. До момента посева пробы тест-система не активна и может храниться длительное время. Для сохранения стерильности компоненты питательной среды покрывают сверху непроницаемой пленкой.

7.3.2 Тест-системы готовят к анализу в соответствии с инструкцией производителя с соблюдением правил стерильности.

Тест-системы помещают на ровную поверхность. Приподнимают верхнюю пленку и в центр подложки (в месте нанесения геля) на поверхность тест-системы вносят 1 или 5 см³ пробы воды или соответствующего разведения, после чего аккуратно опускают верхнюю пленку.

В центр тест-системы выемкой вниз помещают пластиковый распределитель и надавливают на центр распределителя для равномерного распределения пробы. Не допускается перемещать или крутить распределитель по тест-системе.

Убирают распределитель и оставляют петрифильм на 1 - 2 мин для затвердевания геля.

7.3.3 Затем посевы инкубируют при температуре (36 +/- 2) °C в течение 18 - 24 ч.

При инкубировании допускается размещать тест-системы стопкой по 20 шт.

7.3.4 Количество колоний на тест-системы подсчитывают визуально или автоматически с помощью Петрифильм-подобного Ридера или аналога.

Для подсчета отбирают тест-системы, на которых число колоний можно подсчитать визуально.

Полученный результат умножают на величину соответствующего разведения и получают число микроорганизмов в 1 см³ пробы.

При большом количестве колоний на тест-системе может наблюдаться окрашивание всей зоны роста в красный или розовый цвет. Иногда на тест-системах с очень большим количеством колоний в центре может не оказаться видимых колоний, а по краям будет видно множество мелких колоний. В этих случаях результат не учитывается.

Некоторые бактерии могут разжижать гель, что затрудняет подсчет колоний; в этом случае необходимо подсчитывать количество колоний только на неизмененных участках тест-систем.

7.4 Автоматизированный метод посева проб воды или разведений бактериальных культур с аппарата для автоматизированного спирального посева при микробиологическом исследовании

7.4.1 Спиральный метод автоматизированного посева проб основан на распределении точно откалиброванной по объему анализируемой пробы на вращающиеся чашки Петри с агаром по логарифмически убывающей спирали Архимеда.

Способ посева, объем засеваемой пробы и количество последовательных посевов программируются вручную.

7.4.2 Для автоматизированного посева проб используют чашки Петри различного диаметра: 60, 90, 100 мм, в которые разливают питательный агар, предварительно приготовленный из сухого препарата и охлажденный до температуры 50 °C. Перед посевом чашки с агаром комнатной температуры не должны содержать капли влаги на поверхности.

Объем посева: 10, 100, 1000 мкл пробы воды.

Программируемый объем распределения: от 10 до 1000 мкл.

Возможен последовательный посев одного и того же образца на 20 чашек Петри по 10 мкл.

7.4.3 От центра пластины к ее краям исследуемый образец воды распределяется специальным прикрепленным шприцем на поверхность вращающейся чашки Петри с агаром по логарифмически убывающей спирали Архимеда. Это приспособление наливает непрерывно уменьшающийся объем исследуемого образца воды так, что концентрация в центре и у края достигает соотношения 10 000:1.

Распределяемый объем уменьшается по мере нанесения культуры от центра к краю чашки таким образом, чтобы существовала обратно пропорциональная зависимость между радиусом спирали и нанесенным объемом клеточной суспензии. Объем культуры точно откалиброван и известен в каждой точке чашки Петри.

Концентрацию образца определяют путем деления количества выросших после инкубации колоний на объем, распределенный в одном и том же секторе чашки.

7.4.4 Посевы инкубируют в термостате при температуре (36 +/- 2) °C в течение 24 ч.

Интервал подсчета выросших колоний - до 1 x 10¹² КОЕ/см³.

Подсчет колоний на плотных питательных средах осуществляют вручную или с помощью автоматизированных счетчиков колоний.

7.5 Автоматизированный метод подсчета колоний на плотной питательной среде

При использовании ручного счетчика колоний подсчитывают от 0 до 2000 КОЕ на чашках Петри диаметром 60, 90, 100 мм, в том числе с технологией "темное поле".

При использовании автоматических счетчиков колоний минимальный размер подсчитываемых колоний составляет 0,05 мм.

При использовании автоматических счетчиков колоний с самым большим разрешением проводят сканирование 100% поверхности чашки при скорости подсчета колоний 1000 КОЕ/с с использованием ультравысокого разрешения.

Происходит автоматическое разделение слипшихся колоний, а также выполняется детекция и подсчет колоний семи цветов на одной чашке, что важно при посеве на хромогенные среды. Возможен подсчет колоний на мембранных фильтрах и питательных подложках.