ГОСТ Р ИСО 21474-1-2021. Национальный стандарт Российской Федерации. Медицинские изделия для диагностики in vitro. Мультиплексные молекулярные методы для определения содержания нуклеиновых кислот. Часть 1. Терминология и общие требования к оценке качества нуклеиновых кислот

5 Процедура получения нуклеиновой кислоты

 

5.1 Общие положения

Используемый метод экстракции нуклеиновой кислоты должен быть подходящим для получения количества и качества нуклеиновой кислоты, необходимых для последующего анализа.

Оценка нуклеиновых кислот должна проверяться на предмет их пригодности в мультиплексной молекулярной тестовой системе в ее окончательной конфигурации, а не в отдельных одноплексных реакциях, из которых состоит мультиплексный тест.

5.2 Подготовка образцов

5.2.1 Общие положения

В преаналитическом этапе существует множество стадий обработки образцов, включая сбор, фиксацию, хранение, транспортирование, подготовку и обработку. Поскольку эти факторы преаналитического этапа значительно влияют на качество образца и последующие результаты испытаний, необходимо обеспечить соответствующее обращение с образцом [6] - [8], [30].

По мере увеличения числа мишеней в мультиплексном анализе увеличение числа ложноотрицательных результатов для определенных последовательностей может создавать проблемы. В частности, следует оценить качество мишени с наименьшим присутствием таких нуклеиновых кислот в образце, поскольку конкуренция за компоненты реакции может влиять на содержащиеся в малом количестве мишени более значительно, чем на более распространенные.

Пример 1 - В мультиплексных тестах для выявления подтипов вируса папилломы человека при цервикальной инфекции во время сбора образцов можно получить некачественный образец слизистой из шейки матки, например без достаточного количества клеток человека. Это может привести к ложноотрицательному результату теста вследствие непригодного образца. Для проверки отрицательного результата теста в образцах, которые потенциально являются низкокачественными, одновременное обнаружение последовательности генома человека может быть использовано в качестве внутреннего контроля анализа.

Пример 2 - В мультиплексных тестах для определения соматических видов рака относительное снижение интересующих мишеней может происходить, когда доля ненеопластических клеток, таких как воспалительные инфильтраты или эндотелиальные клетки, больше, чем неопластических клеток, что приводит к недооценке или ложноотрицательным результатам определения целевой последовательности.

Пример 3 - В мультиплексных тестах для обнаружения микробных патогенов при инфекции дыхательных путей плохое качество нуклеиновой кислоты, обусловленное высокой вязкостью образца, может возникать во время сбора и подготовки респираторных образцов, что приводит к ложноотрицательным тестам для вида с низкой концентрацией в образце. Проблема может быть сведена к минимуму путем обработки образца NALC (N-ацетил-L-цистеин) и щелочной протеазой.

По мере увеличения числа определяемых мишеней ложноположительные результаты, не имеющие клинической значимости, становятся все более проблематичными, поэтому биологический образец должен быть отобран и обработан таким образом, чтобы избежать ложноположительных результатов, обусловленных контаминацией. Минимизировать проблему поможет использование количественного измерения с применением значения cut-off.

Пример 1 - В мультиплексных тестах для обнаружения бактериальных патогенов в инфекции кровотока контаминация может произойти во время сбора крови, что приводит к ложноположительным результатам теста вследствие присутствия нормальной флоры кожи человека, таким как коагулазонегативный стафилококк. Контаминацию можно уменьшить применением асептических методов при взятии крови, включая антисептику кожи, гигиену рук и предварительно упакованные наборы. Появление в крови нежизнеспособных бактерий может происходить после антимикробной терапии, что приведет к положительным тестам на соответствующие микроорганизмы. Следует избегать взятия крови сразу после введения антимикробных препаратов, что может уменьшить влияние ДНК нежизнеспособных бактерий.

Пример 2 - В мультиплексных тестах для обнаружения видов микобактерий при инфекции дыхательных путей загрязнение может происходить во время сбора респираторных образцов, что приводит к положительным тестам присутствия бактерий окружающей среды, таким как M. gordonae, M. chelonae или M. simiae. Это может быть уменьшено с помощью стерильного аппарата для сбора образцов, такого как бронхоскоп.

5.2.2 Подготовка тканей

Когда методы, основанные на реакциях ферментативной амплификации, используют для мультиплексных молекулярных тестов, ингибиторы, присутствующие в образцах тканей, могут мешать обнаружению или количественной оценке мишеней, представленных в малом количестве, но представляющих интерес по сравнению с более распространенными мишенями. Поэтому ингибиторы должны быть сведены к минимуму настолько, насколько это возможно, чтобы обеспечить измерение каждой интересующей последовательности.

Необходимо оценить наличие и долю опухолевых клеток, чтобы обеспечить интерпретацию результатов теста и установить, необходимо ли обогащение опухолевых клеток в такой степени, чтобы провести оценку каждой интересующей последовательности.

Для образцов FFPE фиксация формалином сопровождается фрагментацией и химической модификацией нуклеиновых кислот, поэтому желательно проводить фиксацию формалином в соответствующем фиксирующем реагенте (т.е. стандартном буферном растворе формалина), при низкой температуре и в кратчайшие сроки [2], [6], [20].

Примечание - Рабочие процессы для предварительного исследования различных типов образцов, таких как фиксированные в формалине и заключенные в парафин (FFPE), замороженные ткани и кровь, описаны в ИСО 20166 [6], ИСО 20184 [7] и ИСО 20186 [8].

Примечание - Нейтральный буферный формалин (НБФ) обычно используется для процесса фиксации.

Примечание - ДНК, полученная из более старых фиксированных формалином парафиновых блоков (например, более трех лет), часто демонстрирует отсутствие дезаминирования цитозина до урацила, что приводит к переходу C:G в T:A в последовательностях ДНК. Обработка урацил-W-гликозилазой может устранить урацил-содержащие молекулы ДНК в таком образце. В качестве альтернативы оценка коэффициентов перехода к трансверсии данных последовательностей путем массивного параллельного секвенирования может быть использована для обнаружения значительного дезаминирования.

 

При работе с образцами тканей небольшого объема, например полученными путем тонкоигольной аспирации, следует учитывать стохастическое смещение, поскольку количество геномных эквивалентов, присутствующих в образце, может быть достаточным для последовательного обнаружения вариантов или организмов с низким присутствием генома или аллелей.

При фиксации формалином и подготовке тканей для мультиплексного выявления соматических видов рака может происходить перекрестное попадание ткани от одного пациента в тканевый препарат другого пациента. Это может привести к положительному результату теста для данного пациента, хотя последовательность нуклеиновых кислот принадлежит образцу другого пациента. Следует позаботиться о том, чтобы свести к минимуму этот риск, обрабатывая ткань на чистой поверхности и используя одноразовые устройства или расходные материалы (например, лезвие, прокладку и контейнер). Если перекрестная контаминация неизбежна, то должен быть разработан соответствующий контроль мультиплексных анализов.

Примечание - Включение полиморфных геномных областей (например, используемых в судебных анализах) в целевые области анализов методом массивного параллельного секвенирования может быть использовано для оценки наличия более чем одного генома пациентов в секвенируемых образцах.

 

5.2.3 Экстракция и очистка нуклеиновых кислот

Метод экстракции или очистки нуклеиновых кислот выбирают с учетом влияния типов образцов и матриц на каждый мультиплексный метод, которому будут подвергать экстрагированную или очищенную нуклеиновую кислоту.

При измерении с использованием некоторых высокочувствительных мультиплексных методов потенциальная контаминация нуклеиновой кислоты реагентами, пробирками и пластиковой посудой может привести к ложноположительным результатам. Использование специально разработанных и изготовленных материалов для этих типов анализов должно быть рассмотрено с целью минимизации контаминации нуклеиновыми кислотами. Кроме того, потенциальная перекрестная контаминация образцов может привести к ложноположительным результатам. Должен быть установлен протокол подготовки и обработки образцов/проб, который должен быть задокументирован и соблюден, чтобы свести к минимуму влияние такого перекрестного загрязнения.

При работе с образцами с ожидаемо низким содержанием нуклеиновой кислоты, чтобы минимизировать потери образца, следует использовать изделия и принадлежности из специализированного лабораторного пластика, например "низкоадсорбирующего пластика" для снижения связывания нуклеиновых кислот.

Примечание - Некоторые материалы для изготовления пробирок связывают нуклеиновые кислоты. Полиалломерные пробирки в качестве емкости для реагентов поглощают меньше ДНК по сравнению с обычными полипропиленовыми пробирками для микроцентрифуги, которые сорбируют до 100 нг ДНК. Средство, такое как 0,02%-ный полиэтиленгликоль монолаурат, на каждой стадии реакции снижает адсорбцию ДНК на стенках пробирок [30].

 

При применении мультиплексного молекулярного теста для обнаружения или количественной оценки мишеней нуклеиновых кислот к потере определенных мишеней нуклеиновых кислот и, как следствие, к ложноотрицательным результатам тестирования может привести снижение эффективности экстракции. Необходимо позаботиться о том, чтобы обеспечить воспроизводимую эффективность экстракции для всех мишеней нуклеиновых кислот, подлежащих тестированию в мультиплексных анализах.

Потенциальное загрязнение нуклеиновых кислот ингибиторами также может привести к ложноотрицательному результату в мультиплексных анализах. Для предотвращения этого явления необходимо эффективно удалять ингибиторы.

Примечание - При агрессивном разрушении клеточных стенок или тканей организма с помощью стеклянных шариков нуклеиновые кислоты имеют тенденцию к фрагментации.

 

5.2.4 Метод оценки качества

Для оценки качества нуклеиновых кислот существует несколько методов, таких как спектры поглощения для определения количества, отношение поглощения от 260 (A260) до 280 нм (A280) для оценки чистоты и гель-электрофорез для оценки длины или целостности фрагмента [31]. Эти значения, однако, не являются надлежащим показателем качества образца для мультиплексных молекулярных тестов, например соотношение A260/A280 при оценке фрагментов для секвенирования.

Примечание - Во всех протоколах подготовки образцов для массивного параллельного секвенирования исходным материалом является ДНК, например, в виде изолированной геномной ДНК и/или комплементарной ДНК (кДНК), полученной в ходе обратной транскрипции, или иммунопреципитированного хроматина. Для преобразования материала в секвенируемую библиотеку исходную ДНК фрагментируют, фрагменты сортируют по размеру и к фрагментам определенной длины в соответствии с используемым протоколом секвенирования лигируют адаптеры. Определение концентрации ДНК и качества фрагментов для секвенирования с помощью соотношения A260/A280 (например, 2,00) не подходит в качестве показателя чистоты подготовленного образца, так как оставшиеся праймеры, свободные нуклеотиды и фрагменты с неверно лигированными адаптерами неотличимы от желаемых, продуктивных фрагментов. Вместо этого для специфического измерения двухцепочечной ДНК необходимы другие методы, такие как использование интеркалирующего флуоресцентного красителя.

 

Соотношение A260/280 может дать важную информацию. Если соотношение A260/280 выходит за пределы диапазона, указанного аналитическим испытанием (выброс) <1>, образец следует удалить. Например, значение < 1,60 может быть весомым признаком того, что в этом образце присутствуют потенциально мешающие соединения, такие как белок, фенол, гуанидин или другие реагенты. Соотношение 260/280 также может быть полезно для определения чистоты продукта ПЦР после очистки для удаления избыточных праймеров/ssDNA и т.д.

--------------------------------

<1> Выброс - результат измерения, существенно отличающийся от других значений выборки (см. ГОСТ Р ИСО 16269-4-2017 "Статистические методы. Статистическое представление данных. Часть 4. Выявление и обработка выбросов").

 

Примечание - Значение A260 также используется для измерения выхода суммарной нуклеиновой кислоты. Это может быть использовано для определения загрязнения геномной ДНК, когда это значение неожиданно велико. Например, когда вирионы ВИЧ измеряют в образцах плазмы крови, высокое значение A260 может быть индикатором загрязнения геномной ДНК из лейкоцитов.

 

Прямые методы оценки состояния фрагментации ДНК включают прямое подтверждение путем электрофореза, оценку ПЦР-амплификации фрагментов ДНК известной длины [например, внутренний контроль (ген или рецептора витамина D) или внесение референсного материала] или оценку реакции амплификации с использованием delta Cq (количественное определение цикла, также известного как пороговый цикл, значение Ct в количественной ПЦР в реальном времени).

Длина фрагментов для секвенирования может быть оценена по разделению фрагментов разного размера при капиллярном электрофорезе или с помощью набора клонированных и секвенированных по Сэнгеру фрагментов.

Для оценки фрагментации РНК методы включают прямое измерение конформации РНК с помощью электрофореза в агарозном геле в денатурирующих условиях. Кроме того, целостность экстрагированной РНК может быть оценена по экспрессии рРНК и генов внутреннего контроля, включая гликоральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAPDH) или бета-актин. При использовании этих генов для нормализации они должны быть валидированы, чтобы убедиться, что они подходят для конкретного теста. Для оценки качества РНК доступны значения RIN или RIS и/или отношение 18S-единицы к 28S-единице рРНК, полученной в результате электрофореза.

Примечание - Анализ показателей качества, алгоритм RIN и рРНК, не всегда является точным индикатором естественной деградации мРНК, особенно в образцах FFPE. Для РНК из FFPE использование парафинового алгоритма метрики РНК (PERM), основанного на формуле, аппроксимирующей взвешенный анализ площади под кривой электроферограммы извлеченной РНК, считается лучше, чем RIN [34].

Примечание - Целью секвенирования РНК является определение содержания РНК в образце количественно. Секвенирование РНК достигается путем выделения интересующей РНК фракции (или селективного удаления незначимых фракций), превращения в двухцепочечную кДНК и использования в реакциях секвенирования.

 

Использование внутреннего контроля, присутствующего на всех этапах экстракции, амплификации и детекции, может быть необходимо для оценки качества нуклеиновых кислот, эффектов ингибиторов и эффективности методов экстракции. Внутренний контроль может быть разработан специально для обнаружения каждой интересующей цели. Мультиплексные молекулярные тесты с таким внутренним контролем могут быть использованы для оценки количества определенных шаблонов в образце, для идентификации патогена, генотипирования или мультиплексного анализа мутаций.