ГОСТ Р ИСО 21474-1-2021. Национальный стандарт Российской Федерации. Медицинские изделия для диагностики in vitro. Мультиплексные молекулярные методы для определения содержания нуклеиновых кислот. Часть 1. Терминология и общие требования к оценке качества нуклеиновых кислот

4 Общие требования

 

4.1 Общие положения

4.1.1 Требования преаналитического этапа

Общие положения о системах менеджмента качества медицинских лабораторий, и в частности о сборе и обработке образцов, приведены в ИСО 15189:2012, 4.2, 5.4.4, 5.4.7 и ISO/TS 20658 [3]. Должны соблюдаться требования к лабораторному оборудованию, реагентам и расходным материалам в соответствии с ИСО 15189:2012, 5.3; также могут применяться требования ИСО 15189:2012, 5.5.1.2 и 5.5.1.3.

Преаналитический этап обычно состоит из следующих процессов:

- сбор, хранение и транспортирование образцов/проб;

- предварительная обработка образцов проб;

- экстракция и очистка нуклеиновых кислот.

Эти факторы в значительной степени влияют на качество образца и последующие результаты испытаний. Детали особенностей преаналитических процедур для молекулярных исследований описаны в [6] - [8], [25] - [30].

Одним из основных факторов преаналитического этапа исследований, оказывающих существенное влияние на результаты аналитических тестов, являются биологические изменения аналита (РНК, ДНК) в образце: индукция генов, подавление экспрессии генов, апоптоз и т.д. Эти эффекты могут зависеть от продолжительности тепловой и холодовой ишемии <1> и температуры окружающей среды до фиксации формалином. Эти факторы являются основным источником неправильных или ненадежных результатов аналитических тестов [6] - [8], [30]. Таким образом, транспортирование ткани перед хранением или фиксацией в формалине должно проводиться в кратчайшие сроки и, возможно, при низкой температуре или под вакуумом.

--------------------------------

<1> В ГОСТ Р ИСО 20166-1-2021 "Молекулярные диагностические исследования in vitro. Требования к процессам преаналитического этапа исследования зафиксированных формалином тканей в парафиновых блоках (FFPE). Часть 1. Выделенная РНК" приведены определения терминов "холодовая ишемия (экстракорпоральное хранение)" и "тепловая ишемия (интракорпоральная ишемия)".

 

Мультиплексные молекулярные тесты - это тесты IVD или медицинские устройства, которые измеряют последовательность двух или более нуклеиновых кислот одновременно. Для мультиплексных молекулярных тестов необходимо применение образца высокой степени качества.

4.1.2 Качество образцов

Источник <2> образца, сбор, обработка, экстракция и очистка должны быть валидированы и верифицированы (при необходимости) для того, чтобы убедиться, что качество нуклеиновой кислоты подходит для всех аналитов или мишеней, которые планируют выявить в исследовании. Панель мишеней для мультиплексного анализа включает мишени, представленные в высокой или низкой концентрации.

--------------------------------

<2> Источник - состояние образца до начала проведения исследования (заморожен, помещен в парафин и т.д.).

 

Изменчивость биологических, физических и химических свойств каждого образца может влиять на качество получаемой нуклеиновой кислоты и, следовательно, на результаты мультиплексных молекулярных анализов. Однако нецелесообразно оценивать все влияния для каждого образца. Лаборатория должна обеспечить получение каждого биологического образца способом, который не допускал бы изменчивости свойств. В случае, если этого нельзя избежать, влияние изменчивости свойств должно оцениваться соответствующим способом, таким как включение в анализ образца внутреннего контроля.

4.1.3 Качество нуклеиновых кислот

Качество нуклеиновой кислоты для мультиплексного молекулярного теста определяют как матрицу нуклеиновой кислоты с соответствующими свойствами, которые гарантируют измерение в ходе мультиплексного молекулярного теста. В то время как общие соображения по оценке качества нуклеиновых кислот совпадают для классических (моно-) и мультиплексных тестов, существуют особые правила для мультиплексных молекулярных тестов из-за потенциальной интерференции или взаимодействия между несколькими мишенями и/или компонентами теста.

Качество выделенной из образца нуклеиновой кислоты зависит от ряда факторов - в частности, от количества, химической чистоты, длины и структурной целостности, а также содержания (копийности) интересующей мишени. Влияние качества следует учитывать в отношении таких параметров анализа, как предел обнаружения и линейный диапазон каждого аналитического метода.

Качество нуклеиновой кислоты для мультиплексного молекулярного теста необходимо оценивать способами, подходящими для используемого метода измерения.

Оценка качества должна определять репрезентативный профиль выделенной нуклеиновой кислоты, обусловленный длиной, количеством, химической чистотой и структурной целостностью или обнаружением, или количеством репрезентативных генов (например, генов внутреннего контроля).

Материалы управления технологическими процессами необходимо использовать для мониторинга как преаналитических, так и аналитических процессов, где это уместно и доступно. Такие материалы следует использовать для мониторинга процедур экстракции и очистки нуклеиновых кислот. Для определения качества нуклеиновых кислот каждой целевой последовательности следует учитывать внутренний контроль.

Примечание - Руководство CLSI MM17-A содержит рекомендации по различным аспектам верификации и валидации мультиплексного тестирования [24].

 

4.2 Мультиплексный молекулярный тест для оценки качества нуклеиновых кислот

4.2.1 Оценка качества нуклеиновых кислот для мультиплексных молекулярных тестов

Термин "ДНК качества ПЦР" описан в ИСО 22174, ИСО 16577 и ИСО 20395. В ИСО 16577 характеризуется как матрица ДНК достаточной длины, качества и структурной целостности для амплификации с помощью ПЦР, а "РНК качества ОТ-ПЦР", также описанная в ИСО 22174, представляет собой образец РНК достаточной длины в количестве, пригодном для обратной транскрипции и ПЦР. Понятия "ДНК качества ПЦР" и "РНК качества ОТ-ПЦР" не применимы к мультиплексным молекулярным методам измерения, включая методы ПЦР или РТ-ПЦР, микрочипы и массивное параллельное секвенирование.

Учитывая, что мультиплексный молекулярный тест является молекулярно-биологическим методом, способным одновременно обнаруживать несколько нуклеотидных последовательностей даже более короткой длины, должны быть разработаны методы оценки качества мультиплексного молекулярного теста нуклеиновой кислоты, подходящие для каждой измерительной системы.

Качество нуклеиновых кислот должно быть определено перед проведением мультиплексного молекулярного теста. Метод, с помощью которого определяют качество нуклеиновых кислот, будет зависеть от нескольких факторов, таких как используемый мультиплексный метод, известное или ожидаемое количество нуклеиновой кислоты, присутствующей в образце, и нуклеиновая кислота, подлежащая анализу (ДНК или РНК). Пользователь должен выбрать наиболее подходящий способ в зависимости от мультиплексного молекулярного теста, который будет использоваться.

Для определения количества, концентрации, чистоты и возможного разрушения нуклеиновой кислоты в образце можно использовать спектрофотометрические и/или флуориметрические методы и/или гель- или капиллярный электрофорез. Качество нуклеиновых кислот следует оценивать на основе распределения размеров, выявленных при электрофорезе нуклеиновых кислот, обнаружения или количества референсных генов [например, генов внутреннего контроля, включая гены домашнего хозяйства (house-keeping genes)]. Для определения качества каждой целевой последовательности нуклеиновой кислоты с целью контроля процесса можно использовать обогащенные внутренние контроли (т.е. образцы, в которые был добавлен интересующий аналит в точно известном количестве). Существуют методы, доступные для оценки качества нуклеиновой кислоты, присутствующей в растворе, как описано в приложениях A - D.

Пример 1 - Качество РНК можно оценить по электроферограмме с помощью соотношения 28S:18s рибосомальной РНК (рРНК) образца, содержащего общую РНК, числа целостности РНК (значения RIN) или балла целостности РНК (RIS) [31], [32].

Несмотря на то, что показатели качества на основе рРНК популярны для тех, кто проводит анализ РНК, они не всегда могут быть полезны для оценки качества мРНК [33].

Пример 2 - Соотношения A260/A280 и A260/A230 могут быть использованы для оценки чистоты РНК.

В случае, если мультиплексные молекулярные тесты предназначены для обнаружения или количественной оценки мишеней различной длины, следует убедиться, что матрица нуклеиновой кислоты имеет достаточное качество для амплификации во всем диапазоне размеров мишеней. Это может быть достигнуто с помощью ПЦР-реакции с наборами праймеров, которые обеспечивают получение фрагментов, оценивающих нижний и верхний диапазоны размеров мишени. Качество матрицы нуклеиновой кислоты, пригодной для анализа, затем может быть оценено на основе распределения размеров, полученных ПЦР-фрагментов с помощью капиллярного или гель-электрофореза.

Для некоторых мультиплексных молекулярных тестов критическим аспектом обеспечения качества образца нуклеиновой кислоты является определение наличия интересующей нуклеиновой кислоты. Например, мультиплексный анализ мишени нуклеиновой кислоты, содержащейся в небольшом количестве в конкретном исходном образце или организме, должен гарантировать, что образец содержит нуклеиновую кислоту из этой (этого) ткани/организма. Подтверждение может быть получено в результате мультиплексного теста, а также предварительным исследованием образца нуклеиновой кислоты, взятого на мультиплексный анализ.

Примечание - Для улучшения обнаружения жизнеспособных патогенов можно использовать одновременное определение рРНК или мРНК. Другой подход может быть рассмотрен для обработки бактерий с помощью интеркаляторов ДНК, которые проникают в инактивированные клетки и ингибируют ПЦР-амплификацию, но исключаются из жизнеспособных клеток.

 

Образец нуклеиновой кислоты должен иметь достаточное количество интересующей последовательности для выявления всех вариаций, присутствующих в популяции. При применении мультиплексных молекулярных тестов для обнаружения или количественной оценки различных последовательностей должно быть обеспечено достаточное количество нуклеиновой кислоты, требуемое в данном методе измерения, в том числе для определения последовательности, присутствующей в меньшем количестве, чем другие.

Пример - При проведении мультиплексной амплификации лигированных зондов (MLPA, Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) используют два денатурированных фрагмента (D-фрагменты) для выявления слабой денатурации ДНК вследствие солевых загрязнений образца.

4.2.2 Оценка количества нуклеиновых кислот

Методы оценки количества нуклеиновых кислот должны быть выбраны в соответствии с ходом эксперимента, использующего мультиплексный молекулярный тест.

В ходе определения количества очищенных нуклеиновых кислот для мультиплексных молекулярных тестов должно быть измерено соотношение целевых участков генома к количеству референсного образца, соответствующих калибровочных и контрольных образцов для сравнения относительного значения нескольких переменных. В этом случае принцип подсчета - определение отношения (в процентах) двух последовательностей ДНК или РНК, в том числе целевой последовательности и контрольного гена или материала (внутренние контрольные гены, референсный материал). Это подтверждение может быть включено в мультиплексный тест или получено в ходе отдельного исследования.