ГОСТ Р ИСО 19001-2021. Национальный стандарт Российской Федерации. Медицинские изделия для диагностики in vitro. Информация, предоставляемая изготовителем с диагностическими реагентами in vitro, применяемыми для окрашивания биологических материалов

Приложение A

(справочное)

ПРИМЕРЫ ИНФОРМАЦИИ, ПРЕДОСТАВЛЯЕМОЙ ИЗГОТОВИТЕЛЕМ

С РЕАГЕНТАМИ, ОБЫЧНО ПРИМЕНЯЕМЫМИ В МЕТОДИКАХ

БИОЛОГИЧЕСКОГО ОКРАШИВАНИЯ

A.1 Общие положения

Следующая информация представляет собой примеры процедур окрашивания и ее не следует рассматривать как единственный способ проведения описанных процедур. Эти процедуры могут быть использованы изготовителем для исследования реактивности красящих веществ и иллюстрируют то, каким образом изготовитель может представить информацию, соответствующую настоящему стандарту.

A.2 Краситель метиловый зеленый - пиронин Y. Пример 1

Информация, предоставленная производителем вместе с красящими веществами, используемыми в данной процедуре для окрашивания (метиловый зеленый или этиловый зеленый и пиронин Y), перечисленными ниже.

A.2.1 Красящее вещество метиловый зеленый

A.2.1.1 Метиловый зеленый краситель

ВНИМАНИЕ - R 36/37/38: Вызывает раздражение глаз, дыхательных путей и кожи; S 26: В случае контакта с глазами немедленно промыть; S 36: Соответствующая защитная одежда и перчатки.

A.2.1.1.1 Описание продукта (наименование):

- метиловый зеленый (синонимы: двойной зеленый SF, легкий зеленый);

- регистрационный номер CAS: 22383-16-0;

- наименование и номер индекса красителя: основной голубой 20, 42585.

A.2.1.1.2 Состав продукта:

молекулярная формула, включающая противоион: C₂₆H₃₃N₃²⁺ 2 BF^4-;

молярная масса с противоионом (или без него): 561,17 г/моль (387,56 г/моль);

массовая доля (содержание) метилового зеленого катиона: 85%, определена с помощью метода абсорбционной спектрометрии; допустимые пределы интерферирующих веществ, приведенные как массовые доли:

- вода: менее 1%;

- неорганические соли: менее 0,1%;

- детергенты: не присутствуют;

- окрашенные примеси, включая кристаллический фиолетовый: не обнаруживаются с помощью тонкослойной хроматографии;

- индифферентные соединения: 14% растворимого крахмала.

A.2.1.1.3 Обращение и хранение

Стабилен при хранении в тщательно закупоренной коричневой бутылке при комнатной температуре (от 18 °C до 28 °C).

Длина волны максимальной абсорбции раствора красящего вещества: 633 нм.

Тонкослойная хроматография: присутствует только один основной компонент, соответствующий метиловому зеленому.

A.2.1.2 Красящее вещество этиловый зеленый

A.2.1.2.1 Описание продукта (наименование):

- этиловый зеленый (синоним: метиловый зеленый);

- регистрационный номер CAS: 7114-03-6;

- наименование и номер индекса красителя: наименование в индексе красителя отсутствует, 42590.

A.2.1.2.2 Состав:

молекулярная формула, включающая противоион: C₂₆H₃₃N₃²⁺ 2 BF^4-;

молярная масса с противоионом (или без него): 575,19 г/моль (401,58 г/моль);

массовая доля этилового зеленого катиона: 85%, определена с помощью абсорбционной спектрометрии;

допустимые пределы интерферирующих веществ, приведенные как массовые доли:

- вода: менее 1%;

- неорганические соли: менее 0,1%;

- детергенты: отсутствуют;

- окрашенные примеси, включая кристаллический фиолетовый: не обнаруживают с помощью тонкослойной хроматографии;

- индифферентные соединения: 14% растворимого крахмала.

A.2.1.2.3 Обращение и хранение

Стабилен при хранении в тщательно закрытой бутылке из коричневого стекла при комнатной температуре от 18 °C до 28 °C.

Длина волны максимальной абсорбции раствора красящего вещества: 633 нм.

Тонкослойная хроматография: присутствует только один основной компонент, совпадающий с этиловым зеленым.

A.2.1.3 Красящее вещество пиронин Y.

ВНИМАНИЕ - R20/21/22: Вреден при вдыхании, попадании на кожу и проглатывании.

A.2.1.3.1 Описание продукта (название):

- пиронин Y (синонимы: pyronine Y, пиронин G, pyronine G);

- регистрационный номер CAS: 92-32-0;

- наименование и номер индекса красителя: наименование в индексе красителя отсутствует, 45005.

A.2.1.3.2 Состав продукта:

молекулярная формула, включающая противоион: C₁₇H₁₉N₂O⁺Cl^-;

молярная масса с противоионом (или без него): 302,75 г/моль (267,30 г/моль);

массовая доля пиронина Y катиона: 80%, определена с помощью абсорбционной спектрометрии;

допустимые пределы интерферирующих веществ, приведенные как массовые доли:

- вода: менее 1%;

- неорганические соли: менее 0,1%;

- детергенты: отсутствуют;

- индифферентные соединения: 19% растворимого крахмала.

A.2.1.3.3 Обращение и хранение.

Длина волны максимальной абсорбции раствора красящего вещества: 550 нм.

Тонкослойная хроматография: присутствует только один основной компонент, совпадающий с пиронином Y.

A.2.2 Предназначенное применение метода окрашивания метиловым зеленым - пиронином Y

Эта процедура используется для демонстрации ДНК (нуклеинов) и РНК (рибосом) в клеточном материале. Это особенно подходит для демонстрации плазменных клеток.

A.2.3 Тип(ы) материала

Краситель метиловый зеленый - пиронин Y применяется для окрашивания свежезамороженных, парафинированных или пластиковых срезов тканей различных видов.

A.2.4 Обращение и обработка перед окрашиванием

A.2.4.1 Возможные фиксирующие средства включают в себя:

жидкость Карноя [этанол (объемная доля 99%) + хлороформ + уксусная кислота (массовая доля 99%), смешанные в объемах (60 + 30 + 10) см³ (мл)]; или

формальдегид (массовая доля 3,6%), забуференный фосфатом (pH = 7,0); высушивание, очистка, пропитывание и покрытие парафином, приготовление срезов с помощью микротома.

A.2.5 Рабочий раствор

A.2.5.1 Приготовление рабочего раствора [15], [16]

a) Готовят раствор этилового зеленого или метилового зеленого из количества, соответствующего массе 0,15 г чистого красящего вещества, рассчитанного как окрашенный катион (в приведенных выше примерах 0,176 г в каждом случае) в 90 см³ (мл) горячей (температура 50 °C) дистиллированной воды [6], [10], [14].

b) Растворяют количество вещества соответствующее, содержанию по массе 0,03 г пиронина Y, рассчитанного как окрашенный катион (в примере, приведенном выше, 0,038 г) в 10 см³ (мл) фталатного буфера (pH = 4,0) концентрацией 0,1 моль/дм³ (моль/л) [9], [13].

c) Смешивают полученный раствор с раствором этилового зеленого или метилового зеленого.

d) Рабочий раствор стабилен по крайней мере одну неделю при хранении в плотно закрытой бутылке из коричневого стекла при комнатной температуре от 18 °C до 28 °C.

A.2.5.2 Методика окрашивания [12], [16]

a) Депарафинируют срезы.

b) Срезы смачивают.

c) Окрашивают срезы в течение 5 мин при комнатной температуре примерно 22 °C в рабочем растворе.

d) Промывают срезы в двух сменах дистиллированной воды, от 2 до 3 с в каждой.

e) Стряхивают излишки воды.

f) Активируют в трех сменах 1-бутанола.

g) Переносят непосредственно из 1-бутанола в гидрофобную синтетическую смолу.

A.2.6 Ожидаемый(е) результат(ы)

Ожидается получение следующих результатов с типами материалов, перечисленными в A.2.4.1:

- для ядерного хроматина: зеленый (фиксатор Карнов) или голубой (фиксатор формальдегид);

- для нуклеол и цитоплазмы, богатой рибосомами: красный (фиксатор Карнов) или лиловато-красный (фиксатор формальдегид);

- для матрицы хрящей и гранул тучных клеток: оранжевый;

- для мышц, коллагена и эритроцитов: не окрашены.

A.3 Реакция Фельгена-Шиффа. Пример 2

Информация, предоставленная производителем с красителем, используемым для получения хромогенного реагента (парарозанилин - реактив Шиффа), применяемого в процедуре окрашивания.

A.3.1 Краситель, использованный в реакции Фельгена-Шиффа

A.3.1.1 Красящее вещество парарозанилин

ВНИМАНИЕ - Для R 40: Возможный риск необратимых эффектов; для R 22: Не вдыхать пыль; для S 36/37: Соответствующая защитная одежда и перчатки.

A.3.1.1.1 Описание продукта (наименование):

- парарозанилин (синонимы: основной рубиновый, парафуксин, парамагента, магента 0);

- регистрационный номер CAS: 569-61-9;

- наименование и номер индекса красителя: основной красный 9,42500.

A.3.1.1.2 Состав:

молекулярная формула, включающая противоион: C₁₉H₁₈N₃⁺Cl^-;

молярная масса с противоионом (или без него): 323,73 г/моль (288,28 г/моль);

массовая фракция парарозанилина катиона: 85%, определена с помощью абсорбционной спектрометрии;

допустимые пределы интерферирующих веществ, приведенные как массовые доли:

- вода: менее 1%;

- неорганические соли: менее 0,1%;

- детергенты: не присутствуют;

- окрашенные примеси: метилированные гомологи парарозанилина могут присутствовать в следовых количествах, определяемые с помощью тонкослойной хроматографии, но акридин отсутствует;

- индифферентные соединения: 14% растворимого крахмала.

A.3.1.1.3 Обращение и хранение.

Стабилен при хранении в тщательно закупоренной коричневой бутылке при комнатной температуре от 18 °C до 28 °C.

Длина волны максимальной абсорбции раствора красящего вещества: 542 нм.

Тонкослойная хроматография: присутствует один основной компонент, соответствующий парарозанилину; возможны метилированные гомологи парарозанилина в следовых количествах.

A.3.2 Предназначенное применение реакции Фельгена-Шиффа

Эта процедура используется для демонстрации ДНК в клеточном материале.

A.3.3 Тип(ы) материала

Реакцию Фельгена-Шиффа применяют для парафинированных или пластиковых срезов различных видов тканей или цитологического материала (мазок, отпечаток ткани, культура клеток, монослой).

A.3.4 Обращение и обработка перед окрашиванием

Возможные фиксирующие вещества включают в себя:

- гистологию: формальдегид (массовая доля 3,6%), забуференный фосфатом (pH = 7,0);

- цитологию:

- жидкий фиксирующий материал: этанол (объемная доля 96%);

- высушенный на воздухе материал;

- формальдегид (массовая доля 3,6%), забуференный фосфатом;

- метанол + формальдегид (массовая доля 37%) + уксусная кислота (массовая доля 100%), смешанные в объемах (85 + 10 + 5) см³ (мл). Материал, фиксированный в фиксаторе Буина, непригоден для этой реакции.

A.3.5 Процедура окрашивания

A.3.5.1 Процедура окрашивания парарозанилином - реактивом Шиффа [11]

a) Растворяют 0,5 г парарозанилин хлорида в 15 см³ (мл) соляной кислоты концентрацией 1 моль/дм³ (моль/л).

b) Добавляют 85 см³ (мл) водного раствора K₂S₂O₅ (массовая доля 0,5%).

c) Ожидают 24 ч.

d) Взбалтывают 100 см³ (мл) этого раствора с 0,3 г древесного угля в течение 2 мин и фильтруют.

e) Хранят бесцветную жидкость при температуре не ниже 5 °C. Раствор стабилен в течение по крайней мере 12 мес в плотно закрытой посуде.

A.3.5.1.1 Раствор для промывания

a) Растворяют 0,5 г K₂S₂O₅ в 85 см³ (мл) дистиллированной воды.

b) Добавляют 15 см³ (мл) соляной кислоты концентрацией 1 моль/дм³ (моль/л). Раствор готов к немедленному применению и может быть использован в течение 12 ч.

A.3.5.2 Методика окрашивания [19], [20]

a) Депарафинируют парафинированные срезы в ксилене в течение 5 мин, затем промывают в течение 2 мин, сначала в этаноле с объемной долей 99%, а затем в этаноле с объемной долей 50%.

b) Смачивают пластиковые срезы, депарафинируют парафинированные срезы и цитологический материал в дистиллированной воде в течение 2 мин.

c) Гидролизируют материал в 5 моль/дм³ (моль/л) соляной кислоты при температуре 22 °C в течение от 30 до 60 мин (точное время гидролиза зависит от типа материала).

d) Промывают дистиллированной водой в течение 2 мин.

e) Окрашивают реагентом парарозанилин в течение 1 ч.

f) Промывают в трех последовательных сменах промывного раствора, по 5 мин в каждой.

g) Дважды промывают дистиллированной водой, по 5 мин каждый раз.

h) Дегидратируют в этаноле с объемной долей 50%, затем с 70% и наконец в 99%-ном этаноле, по 3 мин каждый раз.

i) Дважды промывают в ксилене, по 5 мин каждый раз.

j) Извлекают в синтетическую гидрофобную смолу.

A.3.6 Ожидаемые результаты

Ожидается получение следующих результатов в реакции Фельгена-Шиффа [19], [20]:

- для ядер клеток (ДНК): красный цвет.