ГОСТ Р ИСО 17822-2021. Национальный стандарт Российской Федерации. Наборы реагентов для диагностики in vitro. Процедуры исследования, основанные на амплификации нуклеиновых кислот, для обнаружения и идентификации патогенных микроорганизмов. Руководство по обеспечению качества лаборатории

5 Планирование и практическое внедрение исследований патогенов с использованием МАНК

 

В общем случае требования к проекту методики/теста указываются в техническом задании. Планирование научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ включает в себя:

1 определение потребностей пользователей и требований заинтересованных сторон;

2 определение предполагаемого медицинского применения;

3 эксплуатационные требования и технические характеристики, а также другие проектные требования и технические характеристики, основанные на предполагаемом использовании;

4 оценку риска методики/теста;

5 разработку исследования и квалификацию поставщика компонентов для проведения исследования; должно включать, но не ограничиваться: сбором и обработкой образцов/проб, экстракцией нуклеиновых кислот, амплификацией нуклеиновых кислот, а также обнаружением и идентификацией нуклеиновых кислот целевого патогенного микроорганизма, структурой лаборатории, однонаправленным рабочим процессом и лабораторной практикой;

6 этап технико-экономического обоснования;

7 планирование верификации и валидации;

8 верификацию технических характеристик разработки.

Пример - Предел обнаружения, пограничные значения, аналитическая специфичность (включая перекрестную реактивность и интерференцию), точность, перенос, линейность и, в соответствующих случаях, коммутативность калибратора и отслеживаемость результатов по эталонным материалам или процедурам эталонного измерения;

9 планирование производственного процесса в лабораторных масштабах;

10 валидацию предусмотренного применения;

11 изменения во время и после разработки исследования по сравнению с проектом должны быть задокументированы.

Специфические условия для патогена должны включать, но не ограничиваться: рассмотрением генетических свойств патогена [внутренняя и межвидовая гетерогенность последовательностей, необходимая оперативная таксономическая единица (ОТЕ), специфичность при рассмотрении близкородственных видов, связь с генами резистентности].

Примеры

Использование мультиплексных панелей (например, респираторная панель).

Латентность, носительство, диапазоны референтных значений, релевантные для мультиплексных панелей, которые могут обнаруживать организмы, не включенные в дифференциальную диагностику.

5.1 Материал для контроля качества

5.1.1 Экспертиза материала для контроля качества

Для получения достоверных данных и результатов анализа крайне важен выбор и использование соответствующих средств контроля и контрольных материалов.

В лаборатории должны быть определены требования и соответствующие им технические характеристики контрольных материалов до проведения верификации/валидации. Частота использования выбранных контрольных материалов может быть основана на результатах верификации и валидации.

Для снижения вероятности получения недостоверных результатов вследствие ненадлежащего выполнения всей или части процедуры исследования должны быть использованы определенные средства контроля, в особенности процедуры обеспечения качества должны быть разработаны таким образом, чтобы свести к минимуму ложноположительные и ложноотрицательные результаты.

Внутренние контроли, контроль ингибирования для методов МАНК могут быть гомологичными внешними, гетерологичными внешними или гетерологичными внутренними. Добавленный перед подготовкой образца, внутренний контроль может также служить контролем целого процесса.

Мероприятия по контролю процесса должны применяться для предотвращения потенциальных сбоев двух основных этапов диагностических исследований in vitro при определении нуклеиновых кислот: (1) весь рабочий процесс предварительного исследования от сбора проб/образцов до выделения нуклеиновых кислот и (2) анализ нуклеиновых кислот, включая амплификацию и идентификацию. Методика исследования на основе МАНК должна включать в себя соответствующие средства контроля для полного обеспечения качества и надежности полученных данных.

Примечание 1 - Общее руководство по контролю кПЦР и цПЦР приведено в [12] (пункт 4.4).

 

Обоснование выбора контрольных материалов и процедур должно быть задокументировано.

1 Отрицательный контроль

Цель отрицательного контроля состоит в том, чтобы провести исследование, не имеющее клинической цели, для оценки ложноположительных результатов, вызванных либо технической неспецифичностью, либо контаминацией. Самым простым способом его выполняя может быть осуществление безматричных реакций, однако более усовершенствованный отрицательный контроль реакции может включать нуклеиновые кислоты, которые, вероятно, также будут присутствовать в пробе/образце, например ДНК человека, чтобы также оценить специфичность.

Отрицательный контроль может быть использован для оценки всего процесса, чтобы предоставить дополнительную информацию об источнике ложноположительного результата (например, перекрестная контаминация во время обработки проб/образцов). В этой ситуации могут быть использованы соответствующие биологические образцы или искусственные заменители (например, кровь, исходные растворы), но перед использованием для оценки ложноположительных результатов должно быть установлено, что они свободны от нуклеиновой кислоты мишени патогена.

Дополнительная информация приведена в [3] и [10].

2 Положительный контроль

Целью положительного контроля является выявление ложноотрицательных результатов и оценка качества выполнения исследования. Положительный контроль может оценивать всю процедуру исследования или анализ отдельных проб/образцов. Материалом для положительного контроля может быть очищенная нуклеиновая кислота, очищенные ампликоны, векторы (например, плазмиды), содержащие целевую последовательность нуклеиновых кислот, и искусственная нуклеиновая кислота (см. таблицу 1). Если используют переносчики или амплифицированный материал, то они должны быть разбавлены до подходящей концентрации [<= 107 единиц/мм³ (единиц/мкл)] перед выполнением ПЦР (см. рисунок 1). Это снизит вероятность контаминации от сверхконцентрированных нуклеиновых кислот.

 

Таблица 1

 

Примеры материалов для положительного и отрицательного

контроля

 

Тип контроля	Название контроля	Типичный состав	Основания для включения
Отрицательный	Контроль без матрицы	Вода или буфер без матрицы добавляются в основную смесь	Обнаружение контаминации матрицы на стадии организации ПЦР-исследования. Обнаружение непредусмотренных продуктов амплификации, таких как амплифицированные фрагменты димеров, которые могут попадать в образец при использовании красителей, связывающих дцДНК
Отрицательный	Холостая проба экстракции	Вода, буфер, образец или холостая проба матрицы (в зависимости от обстоятельств) обрабатываются вместе с подвергающимся исследованию пробой/образцом	Обнаружение контаминации матрицы на стадии экстракции
Отрицательный	Отрицательный контроль обратной транскрипции	Обратная транскрипция без добавления обратной транскриптазы или с добавлением денатурированной	Амплификация ДНК (для анализа РНК)
Отрицательный	Особенности	Образец ДНК/РНК, имитирующий образец, но не содержащий целевую матрицу	Характеристика и мониторинг частоты ложноположительных результатов (например, реакции на дикий тип при выявлении мутантного варианта гена)
Положительный	Качественный	Биологический материал с хорошо известными характеристиками или раствор нуклеиновой кислоты	Определяют качество прошедшего теста. Оценка специфичности реакции для генотипирования методом анализа кривой плавления после амплификации
Положительный	Количественный	Биологический материал с хорошо известными характеристиками или раствор нуклеиновой кислоты	Положительный контроль при качественных исследованиях; также для количественной оценки выхода и эффективности исследования или его калибровки
Положительный	Внутренний положительный контроль	Образец, в который намеренно внесена посторонняя матрица	Подтверждение того, что ложноотрицательных результатов не было. Может использоваться в качестве контроля определенного этапа процесса (например, ингибирования) или для оценки всей процедуры (включая экстракцию) в зависимости от типа материала и стадии процесса, на которой образец им заражается
Адаптировано из ИСО 20395:2019.

 

Исходные растворы, содержащие целевой патоген, могут быть использованы в соответствующем и проверенном разведении для использования в качестве положительного контроля (например, для диагностики вирусов).

Концентрации контролей должны быть выбраны для верификации эффективности исследования в целях принятия соответствующих аналитических и клинических решений.

Для качественных методик/тестов положительный контроль (амплификация или экстракция) должен иметь концентрацию, аналогичную нижнему диапазону клинической патогенной нагрузки рассматриваемого образца.

Для количественных процедур, если полученные показания не охвачены калибровочной кривой, следует использовать положительный контроль с высокой активностью вблизи верхнего предела отчетного диапазона и низкой вблизи нижнего предела обнаружения. Калибровочная кривая может представлять собой геномную последовательность нуклеиновой кислоты или ее эквивалента (например, плазмиды, содержащие последовательно разбавленную целевую последовательность нуклеиновых кислот). Однако таким образом невозможно провести оценку динамического диапазона или откалибровать весь процесс. Следовательно, целесообразно, если это возможно, использовать цельный патоген, последовательно разбавленный в соответствующей матрице, чтобы попытаться также проконтролировать линейный динамический диапазон процедуры экстракции. Ампликон не следует использовать для построения стандартной кривой из-за потенциального переноса фрагментов димера.

Если средства контроля разработаны и изготовлены лабораторией (набор образцов матрицы с известной добавкой, внутренние средства контроля и т.д.), следует выделить и хранить достаточное количество отдельных аликвот, чтобы избежать повторных циклов замораживания - оттаивания. Должна быть также определена стабильность средств контроля, разработанных лабораторией. Эти разработанные средства контроля не должны использоваться после истечения установленного срока годности.

По возможности следует осуществлять контроль всего процесса (например, использовать средства контроля, способные также оценивать эффективность преаналитических процедур, например экстракции). Дополнительная информация приведена в таблице 1.

Контроль экстракции может представлять собой партию образцов, взятых от пациента, содержащих целевую нуклеиновую кислоту или матрицу, свободную от патогенов, специально зараженную целевыми патогенами. Матрица должна быть той же, что и в пробах/образцах, подвергающихся исследованию, или аналогичной.

Внутренний контроль и контроль ингибирования (т.е. контроль, способный обнаруживать ингибирование) должен в максимальной степени имитировать целевую последовательность, но не должен обнаруживаться при помощи данного метода анализа. Обычно контроль ингибирования - это материалы нуклеиновых кислот, с помощью которых оценивают молекулярно-биологические этапы исследования (например, ПЦР и обратную транскрипцию).

По возможности в качестве внутреннего контроля используют цельный патоген, а не только нуклеиновые кислоты. Для проведения внутреннего контроля все исследуемые образцы должны быть специально обогащены патогеном в известной концентрации.

При осуществлении внутреннего контроля должны быть продемонстрированы те же характеристики выхода, целостности и чистоты, что и для изолированных целевых последовательностей, не взаимодействующих с целевой нуклеиновой кислотой. Дополнительная информация приведена в [3], [4] и [12].

5.1.2 Распознавание целевой последовательности

Отбор и оценка последовательностей нуклеиновых кислот для использования в качестве праймеров для амплификации с одной стороны и для использования в качестве целевых последовательностей - с другой стороны являются центральным элементом процесса верификации и валидации методов амплификации нуклеиновых кислот.

Как правило, чувствительность методов обнаружения устанавливается в основном эффективностью связывания праймера с последовательностями целевых генов. Точно так же специфичность методов обнаружения в значительной степени зависит от выбора области генома, подлежащей амплификации.

Выбор гена-мишени определяют предусмотренным применением результата исследования в соответствии с перечнем требований к нему.

Примечание 1 - Целевая последовательность нуклеиновых кислот патогена может быть геномной или векторной ДНК, информационной РНК, рибосомной РНК или геномной РНК.

Примечание 2 - Для определения широкого спектра бактерий, как правило, используют гены 16 s рРНК и гены 23 s рРНК, а гены 18 s рРНК и 28 C рРНК - для определения эукариотических патогенов.

 

Для мультиплексного анализа каждая целевая последовательность не должна быть сходна с другой, чтобы минимизировать перекрестную реактивность.

Если выбрана целевая область, то последовательность должна быть оценена на предмет степени ее схожести с другими организмами с использованием соответствующей базы данных последовательностей нуклеиновых кислот. Следует изучить несколько вариантов одной последовательности.

Для отбора праймеров следует знать целевую последовательность и избегать полиморфных областей, кроме случаев, когда полиморфные области используют для распознавания патогена.

Праймеры должны быть разработаны в соответствии с требованиями к проводимому исследованию, например к ПЦР, технологии изотермической амплификации или другим методам.

Следует использовать руководства по разработке, например "Минимальную информацию по публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени [16] или цифровых ПЦР [33]", когда это применимо.

5.2 Верификация и валидация

Исследования можно разделить на четыре группы:

1 одобренные методики/тесты анализа in vitro;

2 одобренные методики/тесты in vitro диагностики, модифицированные лабораторией с целью удовлетворения потребности пациента;

3 методики/тесты, разработанные лабораторией (LDT);

4 методики/тесты, предлагаемые изготовителями, предназначенные для использования только в научных исследованиях.

В таблице 2 представлены возможные мероприятия для проведения верификации или валидации исследования.

 

Таблица 2

 

Возможные мероприятия для проведения верификации

или валидации исследования

 

Тип исследования	Что должна предпринять лаборатория для проведения исследования?
	Верификация	Валидация
Одобренные методики/тесты IVD	Да	Нет
Одобренные методики/тесты IVD, но модифицированные лабораторией	Да	Да
Методики/тесты, разработанные лабораторией (LDT)	Да	Да
Методики/тесты, для использования только в научных исследованиях	Да	Да