ГОСТ Р ИСО 17822-2021. Национальный стандарт Российской Федерации. Наборы реагентов для диагностики in vitro. Процедуры исследования, основанные на амплификации нуклеиновых кислот, для обнаружения и идентификации патогенных микроорганизмов. Руководство по обеспечению качества лаборатории

Приложение A

(справочное)

 

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПО ПОДГОТОВКЕ ОБРАЗЦА К ПРОВЕДЕНИЮ ИССЛЕДОВАНИЯ

 

A.1 Сыворотка и плазма крови

A.1.1 Сбор проб

Для получения сыворотки периферическую кровь берут с помощью вакуумной пробирки для сбора крови, содержащей гель для отделения сыворотки. Пробирку оставляют при комнатной температуре на один час, пока не завершится коагуляция, и затем немедленно центрифугируют. Ускоритель коагуляции, добавляемый в пробирку для взятия крови, может сократить время, необходимое для коагуляции.

Для плазмы следует использовать вакуумные пробирки, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA). Не рекомендуется путать пробы крови с теми, что предназначены для клеточной иммунологии или хромосомного анализа, для которых взятие пробы крови проводится в пробирки с гепарином.

Когда кровь берется через внутривенный катетер, первые несколько миллилитров необходимо удалить из-за потенциального эффекта гепарина, в качества образца должна использоваться последующая проба крови.

Плазма крови, полученная с помощью антикоагулянтов АСД (антикоагулянт цитрат декстроза) или CPD (цитрат-фосфат-декстрозы) также может быть использована для исследований методом амплификации нуклеиновых кислот аналогично обработанной EDTA.

После вакуумного забора крови пробирки с EDTA немедленно и многократно переворачивают и перемешивают чтобы предотвратить свертывание крови до осаждения фибрина. Не должны использоваться пробирки для сбора образцов, содержащие реагент для нейтрализации гепарина, из-за его ингибирующего действия на амплификацию нуклеиновых кислот.

Неудовлетворительными и неподходящими факторами для проведения исследования являются образование осадка, обесцвечивание и дегидратация из-за замерзания. Возможные причины этих явлений включают неподходящие условия хранения, такие как длительное воздействие высокой температуры и повторяющиеся циклы замораживания и оттаивания. Если выделенные нуклеиновые кислоты были надлежащим образом сохранены, их можно использовать для повторного исследования. Количество циклов замораживания и оттаивания должно быть сведено к минимуму и задокументировано.

A.1.2 Хранение и транспортирование образцов

Признано, что образцы вируса относительно стабильны в сыворотке и плазме. После разделения образцы сыворотки и плазмы можно хранить в холодильнике (от 2 °C до 8 °C). Некоторые производители изделий для IVD смогли подтвердить, что, например, образец сыворотки и плазмы может храниться до семи дней при температуре от 2 °C до 8 °C.

Для длительного хранения рекомендуется замораживание. Например, образцы для определения ДНК вируса гепатита должны храниться: при температуре минус 20 °C или ниже - для гепатита B, при температуре минус 70 °C или ниже - для вируса гепатита A, C и E.

Следует избегать перемещения образца в другой контейнер. Если образцы не будут исследованы сразу после центрифугирования, отделенную сыворотку в оригинальной пробирке для сбора крови следует сразу заморозить (при температуре минус 20 °C или ниже) и хранить до использования. Для вируса гепатита C и вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) рекомендуется отделять сыворотку или плазму в течение 6 ч после взятия крови, а для вируса гепатита B лучше всего проводить отделение в течение 24 ч.

A.1.3 Контроль за интерферирующими веществами

Все взятые у человека образцы/пробы могут содержать вещества, которые потенциально могут быть "примесями"; эти вещества могут мешать амплификации и/или обнаружению целевого аналита. Примеси могут быть эндогенными или экзогенными. Примеры эндогенных примесей, которые видны, если присутствуют в достаточно высокой концентрации, включают гемоглобин, триглицериды и билирубин. Другими эндогенными интерферентами могут быть образование значительного количества продуктов патологических процессов, таких как легкие цепи в пробах пациента с миеломой или глюкоза в пробах пациента с диабетом. Эти примеси обычно не видны. Эндогенные примеси также включают вещества, используемые в лечении, такие как антикоагулянты, лекарственные препараты, плазмозаменители и парентеральное питание. Эндогенные примеси также включают вещества, которые принимает пациент, включая алкоголь, рекреационные наркотики, витамины и другие пищевые добавки. Примеси могут быть и "экзогенными" - это интерференты, вносимые во время сбора образцов, в число которых может входить тальк из перчаток. Образцы должны быть собраны в специальную тару, чтобы свести к минимуму воздействие известных интерферентов (например, гепарина). Этапы экстракции иногда могут удалять примеси или инактивировать, но поскольку типов потенциальных интерферентов существует очень много, многие из которых не видны, важно продемонстрировать, что каждый образец или выделенные из каждого образца нуклеиновые кислоты могут быть амплифицированы и может быть обнаружена мишень. Обычно это проводится путем добавления контроля амплификации (внутреннего контроля) к каждому образцу. Если во время исследования количество внутреннего контроля падает ниже установленных пределов (или амплификация не происходит), можно заподозрить наличие интерферентов. Дальнейшая информация приведена в [38], [39].

Включение в состав реагентов для обнаружения внутреннего контроля позволяет оценить ингибирующий эффект в ходе реакции амплификации и снизить частоту ложноотрицательных результатов. При отсутствии внутреннего контроля эффект ингибирующих веществ может быть подтвержден оценкой эффективности амплификации после добавления известного количества плазмидной ДНК в раствор ДНК, извлеченный из образца или кДНК.

A.2 Моча

A.2.1 Сбор проб

Большинство молекулярных методов определения патогенов в образцах мочи диагностируют заболевания, передающиеся половым путем (ЗППП), такие как гонококковые инфекции, хламидиоз и другие. Следует собирать те образцы мочи, в которых с наибольшей вероятностью присутствуют ДНК и РНК патогенного генома. Для этого рекомендуется собирать утреннюю порцию мочи. В противном случае ложноотрицательные результаты из-за вымывания возбудителей при мочеиспускании в течение дня может привести к присутствию большого количества лейкоцитов, эритроцитов и отслоившихся эпителиоцитов. Это может привести к ложноотрицательным результатам.

Для диагностики цитомегаловирусной инфекции у плода или новорожденного рекомендуется использовать первичное опорожнение мочи при рождении.

A.2.2 Хранение и транспортирование образцов

Образцы мочи с подозрением на гематурию или билирубинурию и с большим количеством осадка не подлежат исследованию. Гематурия возникает из-за воспаления мочеиспускательного канала или мочевого пузыря, которое может быть вызвано либо инфекциями, либо неинфекционными этиологиями, такими как радиация. Осадок также образуются при охлаждении образцов. Образцы мочи (взятые от мужчин) используются для исследования нуклеиновых кислот на Chlamydia trachomatis и Neisseria gonococcus. Образцы мочи должны храниться в холодильнике (при температуре 2 °C - 8 °C) и подвергаться процессу экстракции нуклеиновых кислот в течение четырех дней. При правильном извлечении стандартными методами ДНК остается стабильной в течение одной недели или дольше в охлажденном виде (при температуре 2 °C - 8 °C), или же рекомендуется замораживание образца. Не должны исследоваться образцы мочи, ставшие мутными из-за роста бактерий. Возможные причины включают в себя отсутствие возможности хранить образцы в необходимых условиях, например хранение образцов в течение длительного времени в коллекционных контейнерах при неподходящей температуре хранения. Для длительного хранения желательно замораживание образцов.

A.2.3 Подготовка проб

Образцы с подозрением на гематурию или билирубинурию и с большим количеством осадка не подходят для проведения исследования.

Примечание - Для предотвращения контаминации компонентами клеток крови перед выделением и очисткой нуклеиновых кислот эффективно использование низкоскоростного охлажденного центрифугирования при температуре окружающей среды в течение 5 мин. Однако криоконсервированные образцы мочи иногда загрязняются гемоглобином, что неизбежно, поскольку в процессе оттаивания происходит гемолиз.

 

Если целью обнаружения является вирус, то супернатант может быть использован для анализа, однако если мишенью являются бактерии, то следует обратить на супернатант пристальное внимание, поскольку неправильное центрифугирование может осаждать бактериальные клетки. Более важно сделать образец однородным, многократно переворачивая пробирки для сбора образцов. Поскольку осадок часто образуются из-за охлаждения образца, образец должен быть согрет, насколько это возможно, в термостате при температуре 37 °C в течение 30 мин перед взятием пипеткой и последующим анализом. Чтобы свести к минимуму воздействие примесей, целесообразно для экстракции нуклеиновых кислот выбирать реагенты, которые используют фильтры, мембраны или магнитные частицы.

Для контроля фактического ингибирующего влияния примесей на реакции амплификации нуклеиновых кислот следует использовать внутренние средства контроля, входящие в состав наборов реагентов для обнаружения. Если отсутствуют требования стандартов, желательно провести независимое испытание по определению влияния примесей и восстановления свойств после их удаления, используя плазмидную ДНК, содержащую известное количество копий, близкое к пределу обнаружения. Если эффект будет подтвержден, реакция амплификации нуклеиновых кислот может быть воспроизведена после разбавления образца нуклеиновой кислоты. Следует отметить, что проведение этой процедуры составляет некоторый риск: целевая нуклеиновая кислота может быть разбавлена до уровня ниже предела обнаружения, что приведет к ложноотрицательным результатам исследования.

A.3 Мокрота

A.3.1 Сбор проб

Образцы мокроты в основном используются для диагностики и ведения инфекционных заболеваний, таких как пневмония, заболевания, вызванные возбудителями туберкулеза, нетуберкулезными микобактериями и другими.

Для обнаружения микобактерий туберкулеза решающее значение имеет обеспечение качества образцов мокроты. Качество мокроты оценивается при макроскопическом исследовании, чтобы подтвердить наличие именно гнойной мокроты, а не слюны. Если пациенты испытывают трудности с самостоятельным отхаркиванием мокроты, следует рассмотреть возможность сбора мокроты путем аспирации с помощью всасывающих катетеров или использования желудочного сока в качестве альтернативного образца.

В противном случае следует рассмотреть возможность сбора альтернативных образцов, включая скопившуюся мокроту, желудочный сок, жидкость бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) и скарификацию бронхов.

A.3.2 Хранение и транспортирование образцов

Для исследований нуклеиновых кислот образцы мокроты должны быть обеззаражены NALC-NaOH и суспендированы в фосфатном буфере. Суспензии можно хранить в течение недели в охлажденном виде (при температуре 2 °C - 8 °C) и в течение более длительного периода при замораживании. При правильном извлечении стандартными методами ДНК остается стабильной в течение одной недели или дольше в охлажденном виде (при температуре 2 °C - 8 °C). Для длительного хранения желательно замораживание образцов.

Суспензии должны быть разделены на аликвоты перед криоконсервацией, повторных циклов замораживания и оттаивания следует избегать. Стабильность экстрагированных нуклеиновых кислот сильно зависит от условий экстракции.

Не подходят для исследования образцы с низкой вязкостью после хранения в неподходящих условиях, таких как длительное воздействие высокой температуры и повторяющиеся циклы замораживания и оттаивания.

Образцы, состоящие из гнойной мокроты, а не слюны, могут быть оценены макроскопическим наблюдением, и должны использоваться невязкие образцы [S(M) по классификации Миллера и Джонса]. Последнее обычно вызвано недостаточным отхаркиванием больным или ограниченным выделением мокроты. Когда в образце содержится слишком мало мокроты, целевые патогены, такие как кислотоустойчивые бактерии и нетуберкулезные микобактерии, могут быть не обнаружены, что может повлечь ложноотрицательные результаты исследования.

A.3.3 Подготовка проб

В число характеристик, делающих образец непригодным для проведения исследования, входит содержание в мокроте большого количества крови, что вызвано кровоизлияниями из пораженных участков дыхательных путей, например бронхов. Когда в мокроте содержится большое количество крови, загрязнение осадка мокроты гемоглобином после центрифугирования неизбежно, и последующее ингибирование реакции амплификации нуклеиновых кислот в ПЦР- и ТМА-анализах является проблемой. В таких случаях желательно собрать дополнительные образцы мокроты. Это особенно применимо к случаям, когда была собрана только слюна.

Оставшуюся часть мокроты, которая содержит клеточные компоненты и бактерии, окруженные слизью, следует растворить в NALC (N-ацетил-L-цистеин) или semi-alkaline протеазе (SAP) или дитиотреитоле по мере необходимости для устранения вязкости. Затем мокрота должна быть промыта физиологическим раствором или фосфатно-солевым буфером, центрифугирована [при 1190 x g (ускорение силы тяжести) (2500 об/мин для ротора радиусом 170 мм), при температуре 4 °C в течение 10 мин] и использована для экстракции нуклеиновых кислот. Если процедуры предварительной обработки образцов описаны во вкладыше, вложенном в упаковку реагентов, следуют инструкциям производителя. Если цвет осадка после промывки и центрифугирования почти белый, то возможно, что ингибирование реакции гемоглобином при последующих процедурах не произойдет.

A.4 Цельная кровь и костный мозг

A.4.1 Сбор проб

После того как определенный объем крови забирается в пробирки для сбора крови, содержащие антикоагулянт (ЭДТА и другие), пробирки следует немедленно перевернуть и осторожно перемешать. При использовании пробирок для сбора крови, содержащих антикоагулянты (ЭДТА и другие), необходимость добавлять стабилизатор отсутствует.

A.4.2 Хранение и транспортирование образцов

В случае исследований для выявления патогенов, ответственных за бактериемию или сепсис, длительное хранение образцов при температуре окружающей среды может снизить чувствительность обнаружения. Поэтому, если клетки для таких исследований хранятся длительное время, их следует хранить при сверхнизких температурах (минус 70 °C или ниже). Образцы костного мозга (аспират костного мозга) указанного объема следует хранить в специальном растворе для хранения (клеточная культуральная среда, содержащая FBS) с охлаждением (при температуре 2 °C - 8 °C).

A.4.3 Подготовка проб

В образцах, в которых наблюдаются сгустки фибрина, сбор бактерий при центрифугировании затруднен присутствием фибрина, что мешает отбору проб из жидкой фракции; это может привести к потере точности количественных измерений. Сгустки фибрина могут быть распознаны по плохой текучести содержимого пробирки или во время взятия пипеткой.

Перед экстракцией нуклеиновых кислот сгустки фибрина в образце должны быть физически разрушены до их распада, когда фибрин будет распределен по всему образцу. Поэтому, образец и фибрин должны проходить исследование после этого. В процессе экстракции ДНК добавление ДТТ (дитиотреитола) и фермента протеиназы K способствует разрушению фибрина.

Примечание 1 - Эффект, производимый гепарином, может быть уменьшен с помощью наборов для экстракции нуклеиновых кислот, которые основаны на адсорбции нуклеиновых кислот на фильтрах, мембранах или магнитных частицах с последующим вымыванием любых примесей. Однако полностью удалить примеси невозможно. Загрязнение гепарином может быть устранено путем полной переработки образца гепариназой. Поскольку количество патогенов, ответственных за бактериемию или сепсис в образце, зависит от состояния пациента во время сбора образца, персоналу, задействованному в исследовании, должна быть предоставлена соответствующая информация.

Примечание 2 - Обработка протеиназой K может повысить эффективность экстракции ДНК и в некоторых случаях обеспечить ее обнаружение в некоторых образцах, содержащих небольшое количество бактерий, ответственных за бактериемию или сепсис.

 

A.5 Плевральный выпот, асцит, перикардиальная жидкость, панкреатическая жидкость и жидкость бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ)

A.5.1 Сбор проб

Во время сбора образцов следует избегать попадания в пробу компонентов клеток крови. Для сбора плеврального выпота следует использовать пробирки/контейнеры, содержащую цитрат натрия или ЭДТА, так как плевральный выпот иногда свертывается после сбора из-за отложения фибрина.

A.5.2 Хранение и транспортирование образцов

Нуклеиновые кислоты должны быть выделены в день сбора образцов, в противном случае они должны быть охлаждены (до 2 °C - 8 °C). Каждый образец должен быть охлажден (до 2 °C - 8 °C) после сбора или заморожен (минус 70 °C или ниже) для длительного хранения. Чтобы предотвратить рост бактерий в образцах после сбора, следует строго соблюдать инструкции по условиям хранения образцов. Гнойные образцы содержат совершенно разные типы бактерий, и существует вероятность, что извлечение ДНК с помощью щелочной термической обработки приведет к тому, что обнаружить патоген будет невозможно.

A.5.3 Подготовка проб

Если из-за гемолиза в образцах присутствует большое количество клеточных компонентов, включая гемоглобин, есть опасение, что чувствительность обнаружения будет снижена из-за ингибирования ПЦР-амплификации.

В образцах с фибриновыми сгустками сбор бактерий при помощи центрифугирования затруднен, и может быть затруднен точный отбор проб, что в свою очередь может привести к снижению количества и невозможности определить показатели количественного анализа. Сгустки фибрина могут быть распознаны по наблюдаемой текучести содержимого пробирки или во время взятия пипеткой. Перед экстракцией нуклеиновых кислот сгустки фибрина в образце должны быть физически разрушены до их распада, когда фибрин будет распределен по всему образцу. Затем в исследовании используется весь образец, содержащий фибрин. В процессе экстракции ДНК добавление вяжущего диссоциирующего и достаточно диспергирующего фибрина происходит по всему образцу. Затем в исследовании используется весь образец, содержащий фибрин. В процессе экстракции ДНК добавление ДТТ (дитиотреитола) и протеиназы K способствует разрушению фибрина.

Примечание 1 - В образцах, загрязненных компонентами крови, ингибирующее действие гемоглобина из эритроцитов после ПЦР-амплификации может быть устранено гемолизом путем добавления к образцу стерильной дистиллированной воды с последующим центрифугированием и извлечением ДНК из осадка. В качестве альтернативы ПЦР может быть выполнена с использованием экстрагированного разбавленного раствора ДНК для снижения концентрации ингибирующих веществ.

 

A.6 Лимфатические узлы и твердые ткани (биопсия или хирургическое вмешательство)

A.6.1 Сбор проб

Во время сбора образцов пораженные участки следует изолировать от здоровых участков и сохранить. Морфологическое исследование образца ткани полезно для того, чтобы отличить целевые клеточные компоненты от других компонентов и чтобы их можно было отделить и взять для исследования. Для крупных образцов или образцов чрезмерно большого размера доля пораженного участка (мишени теста) по отношению ко всему образцу будет меньше. На пораженном участке могут присутствовать другие ткани, что может снизить чувствительность обнаружения, что в конечном итоге приведет к ложноотрицательным результатам. При обнаружении микобактерий туберкулеза поражение участка может быть подтверждено морфологическим исследованием с помощью микроскопии.

A.6.2 Хранение и транспортирование образцов

Образцы тканей, собранные путем биопсии или хирургического вмешательства, должны быть немедленно заморожены при сверхнизких температурах (минус 70 °C или ниже), чтобы предотвратить деградацию нуклеиновых кислот вследствие аутолиза тканей. В это время желательно оставить только пораженные участки, отделив их от собранной ткани.

При выявлении микобактерий туберкулеза поражение участка может быть подтверждено морфологическим исследованием.

В случае фиксации формалином и парафином образцы тканей, собранные путем биопсии или хирургического вмешательства, должны быть как можно скорее пропитаны фиксатором. Если фиксация не может быть выполнена немедленно, желательно, чтобы образцы тканей хранились в холодильнике (4 °C) и фиксировались в течение приблизительно трех часов. Транспортирование образцов тканей осуществляют оперативно при температуре 2 °C - 8 °C.

A.6.3 Подготовка проб

На пораженном участке могут присутствовать другие ткани, что может снизить чувствительность обнаружения, что в конечном итоге приведет к ложноотрицательным результатам.

При обнаружении бактерий туберкулеза поражение участка может быть подтверждено морфологическим исследованием с помощью микроскопии.

Лазерная микродиссекция позволяет точно собрать целевые клеточные компоненты из подготовленного замороженного участка ткани на предметном стекле. Самый простой и легкий метод заключается в ручном сборе целевых клеточных компонентов - с помощью бритвы, максимально удалив ненужные клеточные компоненты из парафинового среза ткани на предметном стекле.

Существует опасение, что контаминация эритроцитами вызывает плохую амплификацию в ПЦР, что приведет к ложноотрицательным результатам при выявлении Helicobacter pylori (H. pylori) при использовании биопсийных тканей желудка и вируса гепатита C и B при использовании биопсийных тканей печени. Загрязнение эритроцитами можно обнаружить визуальным наблюдением ржавого цвета или измерением концентрации гемоглобина.

Ингибирующий эффект загрязняющих примесей после ПЦР-амплификации может быть уменьшен с помощью наборов для экстракции нуклеиновых кислот, основанных на методе очистки, в котором нуклеиновые кислоты адсорбируются на фильтрах, мембранах или магнитных частицах, а примеси вымываются и удаляются.

A.7 Кал

Ингибирующий эффект, влияние которого может быть различным, может возникать в зависимости от того, что пациент ел накануне. Это должно быть принято во внимание.

A.7.1 Сбор проб

Кал использовался в качестве образца для молекулярных методов обнаружения патогенов, в первую очередь для диагностики вирусной диареи. Образцы кала также используются для идентификации энтерогеморрагической Escherichia coli или, реже, для выявления генов веротоксина. Поскольку образцы собираются в момент, когда диарейный симптом наиболее выражен, большинство из них имеют водянистый характер. При сборе образца кала вне медицинских учреждений сбор должен проводиться строго в соответствии с инструкцией.

A.7.2 Хранение и транспортирование образцов

При отсутствии добавок, позволяющих сохранить образец кала, он должен быть заморожен при температуре минус 20 °C или ниже, в зависимости от обстоятельств, в течение одного дня после взятия образца. В противном случае его качество может ухудшиться. Длительное хранение образцов при температуре окружающей среды приводит к развитию различных нецелевых бактерий, снижению чувствительности обнаружения целевого патогена и увеличению частоты неспецифических событий амплификации, что в конечном итоге приводит к ложноотрицательным результатам. Возможно также, что нуклеиновые кислоты вирусов будут деградировать под действием протеаз и нуклеаз, продуцируемых бактериями, что приведет к ложноотрицательным результатам исследования.

A.7.3 Подготовка проб

Технически трудно обнаружить ухудшение качества образцов до проведения анализа. Всегда существует вероятность того, что чувствительность обнаружения целевого патогена при исследовании методом амплификации нуклеиновой кислоты снизилась, потому что ухудшение качества не может быть легко распознано до проведения исследования.