ГОСТ Р ИСО 17822-2021. Национальный стандарт Российской Федерации. Наборы реагентов для диагностики in vitro. Процедуры исследования, основанные на амплификации нуклеиновых кислот, для обнаружения и идентификации патогенных микроорганизмов. Руководство по обеспечению качества лаборатории

7 Проектирование и разработка теста в лаборатории (LDT)

 

7.1 Общие положения

Этап планирования разработки теста в лаборатории должен состоять из этапа проектирования и этапа технико-экономического обоснования. На этапе технико-экономического обоснования должны быть собраны первые данные о результативности, а также должны быть использованы процессы, направленные на устранение проблем и оптимизацию для установления характеристик результативности и разработки приемлемой процедуры валидации.

Для технического обоснования на этапе планирования в лаборатории должно быть проанализировано наличие необходимого оборудования, реагентов, возможные затраты, наличие контрольных и стандартных образцов, необходимых для разработки исследования. Ожидаемая продолжительность и технико-экономическое обоснование процедуры исследования должны учитываться при проектировании и валидации метода исследования.

Примечание 1 - При введении в практическое применение методик количественного анализа/исследования с маркировкой IVD ожидаемые характеристики результативности указываются производителем. Цель принятого плана верификации - проверка технических характеристик исследования в конкретных лабораторных условиях.

 

Процесс разработки исследования должен включать в себя первоначальную оценку (потребности, предусмотренное применение, требования к разработке), планирование конструирования и разработки, разработку исследования, верификацию, валидацию и внедрение в лаборатории. Дальнейшая информация приведена в ИСО 20395 [12].

7.1.1 Определение потребностей потребителя/пациента и заинтересованных сторон в предполагаемом применении исследования

При планировании разработки должны быть учтены правила и этические принципы для поддержания доверительных отношений с потребителями исследования, пациентами и общественностью [5].

Условия и требования заинтересованных сторон, например регулирующих или законодательных органов, должны быть определены и задокументированы.

Потребности потребителя/пациента должны быть определены и задокументированы.

Должны быть определены процедуры сбора и обработки проб/образцов, а также критерии их принятия/отклонения.

Должно быть валидировано предусмотренное применение метода исследования, включая клиническую эффективность.

Предусмотренное применение должно определяться с учетом следующих факторов, включая, но не ограничиваясь ими:

a) цель, выгода и сфера применения метода исследования (например, скрининг, диагностика, прогнозирование, мониторинг, подтверждение диагноза);

b) целевая популяция;

c) использование полученных результатов для целей ведения пациента;

d) типы проб/образцов;

e) процедуры сбора и обработки;

f) критерии для принятия или отклонения проб/образцов.

Должно быть принято решение о том, продолжать ли планировать проектирование и разработку.

7.1.2 Общие критерии верификации исследования

В лаборатории должны быть верифицированы основные характеристики результативности одобренной методики исследования in vitro, описанные в инструкциях изготовителя, чтобы продемонстрировать эти характеристики в соответствующих условиях. Для качественных исследований (тестов) положительные и отрицательные результаты испытаний сравнивают с сопоставимым методом испытаний. Для количественных исследований (тестов) проводят сравнение результатов испытаний по всему отчетному диапазону (точности) и исследования прецизионности. Кроме того, следует верифицировать заявление изготовителя о пределах обнаружения/регистрируемого диапазона и неопределенности измерений, если это применимо, а также в лаборатории должны быть верифицированы референтные интервалы, если они указаны. Дополнительная информация приведена в приложении B.

Если лаборатория разрабатывает метод исследования (LDT) или модифицирует одобренный метод исследования in vitro, то необходимо провести верификацию, установив и задокументировав требования, например к точности, прецизионности, аналитической чувствительности, аналитической специфичности (влияние интерферирующих веществ), регистрируемому диапазону и референтным интервалам в качестве клинически применимых. Данные об интерферирующих веществах могут быть получены из открытых источников или из результатов исследований, проведенных в других лабораториях, однако в лаборатории, проводящей исследования, необходимо верифицировать эту информацию (при возможности).

Верификация должна происходить в лаборатории, где будет проводиться клиническое исследование; если верифицированный метод исследования будет применяться в другой лаборатории, то в этой лаборатории требуется определить, что перемена места или какое-либо изменение условий окружающей среды (температуры, влажности и т.д.) на характеристики результативности не повлияли.

При применении в лаборатории одобренных методов исследований in vitro выполнение условий их проведения должно быть валидировано.

Процедура верификации (например, планирование верификации, ее выполнение), данные и результаты должны быть задокументированы в соответствии с требованиями к процессу разработки исследования как часть действующей лабораторной системы менеджмента качества, а также как возможные объяснения любых расхождений в результатах. Точность, прецизионность и регистрируемый диапазон должны быть проанализированы, и, если они удовлетворительны, метод должен быть одобрен руководителем лаборатории или назначенным лицом как приемлемый для использования в качестве диагностического исследования до использования на пробах пациентов.

7.1.3 Особые критерии верификации требований технического задания для исследования

Должен быть проведен анализ риска потенциального влияния всех этапов диагностического процесса на валидность и надежность обследования.

Как правило, все этапы диагностического процесса, которые могут оказать влияние на результат исследования, должны быть определены и верифицированы, например сбор проб/образцов, транспортирование, хранение, предварительная обработка, выделение, потенциальное хранение после выделения, этапы исследования, такие как амплификация, анализ данных, представление данных.

Анализ риска должен определять влияние любых факторов, которые не могут контролироваться в течение всего диагностического процесса. Должны быть приняты меры по снижению выявленных неприемлемых рисков.

Данные, передаваемые внутри лаборатории, должны быть проверены в ходе верификации; если в дальнейшем данные передаются из лабораторной информационной системы в больничную, то точность передачи данных должна быть верифицирована после того, как первоначальные пробы/образцы были исследованы и результат был зарегистрирован.

Исследования должны включать соответствующие средства контроля, позволяющие обнаруживать ошибки на аналитических этапах рабочего процесса (см. 5.1).

Валидация должна проводиться на искусственной матрице, используемой в окончательном исследовании, и на клинических образцах.

Биологические образцы, про которые известно, что они содержат определенное количество патогенов, могут быть разбавлены соответствующей матрицей без мишеней (например, образцы смешанной сыворотки или суспензии кала), а в образцы может быть специально введен внутренний контроль.

В искусственную матрицу должен быть введен цельный патоген и внутренний контроль.

Следует избегать контаминации или введения интерферирующих веществ. В испытательную систему должен быть встроен постоянный контроль потенциальной контаминации и/или интерференции.

Для мультиплексных анализов метод должен быть валидирован в мультиплексном тесте, для использования в котором он предназначен, например в которой присутствует несколько патогенов и/или патоген и контроль.

7.1.4 Валидация предполагаемого применения

В соответствии с планом валидации лаборатории необходимо описать и задокументировать соответствующие характеристики результативности исследования при заболевании или другом клиническом контексте, оцениваемом в исследовании.

В лаборатории требуется определить те характеристики исследования, которые напрямую связаны с его клинической значимостью и клиническим применением. Эти характеристики должны быть задокументированы как характеристики клинической результативности.

Чтобы установить, определяет и/или количественно оценивает методика/тест анализируемый материал значимым с клинической точки зрения образом, следует при необходимости рассчитать отрицательную и положительную прогностическую значимость.

Примечание 1 - Типичные характеристики клинической результативности включают клиническую (диагностическую) специфичность, клиническую (диагностическую) чувствительность, диапазон измерений и референтный интервал.

 

В лаборатории требуется провести валидацию предусмотренного применения исследования в сравнении с существующими аналогами, если такие имеются. Если существующий аналог недоступен, в лаборатории необходимо валидировать его предусмотренное применение с помощью надлежащим образом разработанных исследований.

Результаты валидации должны быть задокументированы в лабораторном отчете о валидации. Дальнейшая информация приведена в 7.4.1.1 и в приложении B.

7.2 Анализ проведения диагностики с использованием МАНК

Доверие к результатам исследований имеет первостепенное значение в сфере лабораторной диагностики из-за психосоциальных, медико-правовых и терапевтических последствий для пациентов.

В связи с этим скрининг с использованием тестируемого метода или предварительные исследования предназначены для выявления присутствия целевого организма.

Типичные исследования на основе амплификации нуклеиновых кислот будут состоять из комбинации этапов, которые должны включать:

- сбор, транспортирование и хранение проб/образцов;

- экстракцию и очистку нуклеиновой кислоты;

- амплификацию (денатурацию, отжиг, элонгацию);

- обнаружение ортогональных генов;

- анализ и интерпретацию данных.

Важнейшей задачей на всех аналитических этапах исследования с использованием МАНК является предотвращение контаминации продуктами переноса.

7.2.1 Требования к проведению преаналитического этапа

Требования к сбору, транспортированию и хранению проб/образцов должны быть указаны в инструкции по применению. Применяют требования ИСО 15189.

Примечание 1 - Руководство по сбору, транспортированию, подготовке и хранению образцов для молекулярных методов приведено также в [6].

 

Особое внимание должно уделяться потенциальному воздействию сбора, транспортирования и хранения проб/образцов на этапы, необходимые для подготовки образца к экстракции нуклеиновыми кислотами.

Пример - Тип проб/образца, контейнер для проб, критерии приемлемости, процедура обработки для минимизации изменений, вызванных деградацией или загрязнением нуклеиновой кислоты, требуемое количество, требуемые добавки, условия транспортировании, условия хранения, факторы стабильности и предосторожности.

В клинико-диагностической лаборатории должны выполняться требования к сбору, транспортированию и хранению биологического материала человека в качестве инструкций в соответствующих разделах руководства по сбору или взятию проб/образцов.

Биологический материал для исследования с применением МАНК должен быть получен и помещен в зону, изолированную от испытательной. Биологический материал, взятый от пациентов, должен быть быстро обработан и надлежащим образом сохранен, чтобы свести к минимуму деградацию нуклеиновых кислот. Пробы должны принимать в лабораторию только в контейнерах установленного типа <*>. Дальнейшая информация представлена в приложении A.

--------------------------------

<*> См. ГОСТ ISO 6710-2011 "Контейнеры для сбора проб венозной крови одноразовые. Технические требования и методы испытаний".

 

Повторное замораживание и оттаивание могут привести к потере целостности пробы/образца и снижению выхода нуклеиновых кислот, и поэтому этого следует избегать, если не указано и не верифицировано иное. Методы количественного анализа и обнаружения низкого уровня целевых патогенов подробно описаны в [10].

Условия, обеспечивающие надлежащую обработку и стабильность нуклеиновой кислоты после экстракции, должны быть определены, верифицированы и задокументированы в инструкции по применению. Стабильность может отличаться, если при исследовании в одних и тех же условиях используют разный биологический материал. Поэтому стабильность должна быть проверена для каждого типа биологического материала исследования. Новые патогены и необычные синдромы, как правило, требуют дополнительных исследований, чтобы определить наилучший тип и объем для проведения количественного анализа. Дальнейшая информация представлена в приложении A и [3].

Чистота, целостность и выход нуклеиновой кислоты, извлеченной из биологического материала, должны быть достаточными для предусмотренного применения. Если в пробе не содержится достаточного количества нуклеиновой кислоты, экстракция должна быть проведена повторно с использованием той же пробы, либо для экстракции должна быть отобрана другая проба.

Дополнительная информация приведена в приложении A, также дополнительная информация о получении и стабильности нуклеиновых кислот приведена в [7]. Методы оценки эффективности экстракции также приведены в [12], [14], [15].

Чтобы обеспечить достаточную чистоту, целостность и стабильность для проведения исследования, в лаборатории необходимо подготовить и хранить экстракт нуклеиновой кислоты в соответствии с инструкциями по применению.

7.2.2 Требования к проведению аналитического этапа

Лабораторные процедуры должны включать, как минимум, следующие меры предосторожности, когда это применимо, для снижения вероятности контаминации. Требования к использованию отдельного оборудования и расходных материалов не применяют, если подготовку проб, амплификацию и определение наличия патогена выполняют на новых автоматизированных приборах.

a) Средства индивидуальной защиты (СИЗ) должны использоваться в соответствии с уровнем биобезопасности (см. [1], [8], [9]):

- для зон с конкретным назначением следует использовать специальные лабораторные халаты (например, с цветовой кодировкой). Лабораторные халаты должны быть личными, должны меняться при входе или выходе из каждой зоны, регулярно сменяться, должны учитываться конкретные требования к их стирке. Также возможно использование одноразовых лабораторных халатов. Для лабораторных халатов должны быть доступны индивидуальные вешалки, которые не должны соприкасаться друг с другом;

- перчатки меняют при переходе между каждой отдельной зоной, а также дополнительно, если это необходимо, для предотвращения перекрестного загрязнения. Возможно использование перчаток с длинными рукавами, а в целях избежания аллергии предпочтительны перчатки без латекса;

- сотрудники, задействованные в исследовании, должны носить защитные очки, маску для лица, защитный экран или другие средства индивидуальной защиты, в соответствии требованиями правил биобезопасности;

- требования к бахилам или моющейся лабораторной обуви следует рассматривать для разных помещений, где это необходимо.

b) Следует использовать отдельное оборудование (включая робототехническое) и соответствующие расходные материалы, такие как фильтрованные наконечники пипеток для приготовления реагентов, подготовки биологического материала и пост-амплификационного анализа.

c) Чтобы свести к минимуму перекрестную контаминацию, рекомендуется использовать импульсное вращение для всех проб/образцов перед открытием любой ПЦР-реакционной трубки, если этого требует метод исследования.

d) Образец или экстракт нуклеиновой кислоты следует добавлять в реакционную пробирку последним - после компонентов, не относящихся к образцу (таких как мастермикс, дНТФ, праймеры, буфер и ферменты), в отдельной области или помещении, предназначенном для добавления матрицы (см. рисунок 1).

e) Пробирки с реагентами закрывают, если они не используются для манипуляций с ПЦР-ампликонами после амплификации (например, в гель-электрофорезе или секвенировании ДНК). Открывают пробирки как можно реже, и только те пробирки с материалом, которые необходимо использовать. Проводят импульсное вращение пробирок для ПЦР перед откупориванием.

f) Рекомендуется избегать перемещения оборудования (в том числе компьютерного) между различными рабочими зонами. Переносные предметы, такие как пипетки, перчатки, ручки, лабораторные книги и таймеры, являются источником загрязнения и не должны перемещаться между рабочими зонами и быть индивидуальными для каждой рабочей зоны. Кроме того, это правило относится и к документированным процедурам и другим печатным и письменным материалам, таким как рабочие листы. Любое перемещение проб/образцов и материалов, связанных с исследованием, должно быть однонаправленным (от менее загрязненных зон к наиболее загрязненным) и сведено к минимуму (см. рисунок 1).

 

 

	- продукт амплификации;		- ПЦР-реакция с матрицей;
	- мастермикс без матрицы;		- извлеченная матрица

 

Рисунок 1 - Пример однонаправленного рабочего процесса

с использованием отдельных помещений или рабочих зон

 

Для пре-ПЦР, пост-ПЦР и, при необходимости, вложенной ПЦР должны использоваться как минимум две (или, в случае вложенной ПЦР, три) отдельные комнаты. Соответствующие этапы рабочего процесса (обозначенные пунктирными линиями) должны проводиться в выделенных зонах или отдельных помещениях.

Холодильники и морозильные камеры не должны быть общими для помещений/зон подготовки реагентов и проб, чтобы избежать хранения образцов и изолятов нуклеиновых кислот вместе с реагентами. Если необходимо использовать общие холодильные установки, следует установить четкое разделение (например, с помощью вторичной упаковки) [10]. Реагенты, используемые до и после амплификации, и нуклеиновые кислоты (например, образцы и продукты ПЦР) должны храниться в отдельных холодильниках или морозильных камерах, расположенных отдельно в соответствующих помещениях/зонах.

7.2.3 Требования к проведению постаналитического этапа

Последний этап рабочего процесса - интерпретация результатов исследований анализируемых проб/образца и подготовка протоколов исследования. Эти лабораторные отчеты могут поддерживаться лабораторной информационной системой, которая должна быть запрограммирована так, чтобы можно было использовать произвольный текст и предварительно заготовленные шаблоны отчетов.

Требования к протоколам исследований должны соответствовать нормативным требованиям и должны быть интегрированы в систему управления качеством лаборатории. Требования к отчетности должны быть приведены в документированных процедурах или в руководстве по качеству лаборатории.

7.3 Верификация и валидация характеристик эффективности

7.3.1 Пределы обнаружения

Полученные количественные результаты указываются в лабораторных отчетах, только если они попадают в диапазон измерений, установленный в ходе верификации или валидации.

Для качественных МАНК, как правило, определение линейного диапазона в рамках исследования, проводимого с целью верификации, не выполняется. Однако элементы этой концепции могут применяться для полуколичественных исследований, результаты которых рассматривают как качественные.

Нижняя граница линейного диапазона должна быть клинически значимой и приемлемой для клинического применения. Верхний предел линейного диапазона также должен быть клинически значимым, если это возможно.

Если результат превышает верхний предел линейного диапазона, то, возможно, необходимо развести пробу/образец в соответствующем буфере или матрице. Требуется учитывать, что низкая прецизионность будет влиять на предполагаемую линейность исследования. В связи с этим необходимо проводить исследования прецизионности в рамках исследования линейности.

В исключительных случаях взятые дополнительно пробы/образцы могут подвергнуться исследованию, чтобы достоверно определить нижний предел количественного определения.

Дальнейшая подробная информация представлена в приложении B.

Более подробное техническое руководство по валидации МАНК приведено в [12] и [41].

Чтобы определить линейный диапазон для исследований, разработанных в лаборатории, рекомендуется использовать образцы 5 - 10 концентраций в предполагаемом диапазоне измерений.

Для определения максимально широкого линейного диапазона можно использовать дополнительные пробы в концентрациях, превышающих ожидаемый диапазон измерений. Несмотря на возможность использования в лаборатории метода линейного регрессионного анализа для оценки данных, если связь между назначенными и наблюдаемыми значениями явно линейна, предпочтительно выбирать логарифмическую модель для приближения данных, полученных на основе ПЦР (Cq, Ct и Cp).

Примечание 1 - Логарифмическое преобразование состоит в том, что берут логарифм (обычно по основанию 10) каждого наблюдаемого значения.

 

Лаборатории должны отчитываться о полученных количественных результатах, только если они попадают в линейный диапазон. См. дополнительные указания по линейности для МАНК в ИСО 20395 [12].

Примечание 2 - Полиномиальный регрессионный анализ проводят для того, чтобы найти полиномиальную функцию, значения которой соответствуют данным реальной выборки, и для того, чтобы определить, существует ли значительная разница между линейным и квадратичным приближением. Применение полиномиального регрессионного анализа первого, второго и третьего порядка может быть полезным.

 

7.3.2 Точность теста (правильность и прецизионность)

Различные характеристики диагностической точности связаны с различными аспектами диагностической процедуры: одни характеристики используют при оценке способности метода исследования правильно идентифицировать негативные результаты, другие - при оценке его прогностической способности. Характеристики диагностической точности не являются фиксированными показателями результативности исследования: некоторые из них очень чувствительны к распространенности заболевания, другие - к его вариациям и важнейшим признакам. Кроме того, характеристики диагностической точности чрезвычайно чувствительны к программе исследования. Исследования, не соответствующие нормативным документам, как правило, имеют завышенные или заниженные показатели результативности, а сфера применимости их результатов ограничена [35].

Точность процедуры исследования выражает степень близости найденного значения и значения, которое принимается либо как условное истинное, либо как принятое опорное значение. Наблюдаемая степень близости является результатом систематической погрешности (смещения, выраженного как правильность) и случайной ошибки (выраженной как прецизионность).

7.3.2.1 Исследования правильности

Лаборатория должна проводить апробацию в течение времени, необходимого для демонстрации результативности метода в типичных лабораторных условиях.

Исследования правильности должны проводиться в соответствии с программой исследования, статистическими рекомендациями и ИСО 15189.

Для мультиплексного анализа следует использовать несколько сравнительных исследований, если ни один из методов анализа, применяемых обычно, не охватывает все анализируемые вещества мультиплексного анализа. Должен быть выбран подходящий метод анализа данных для установления правильности для каждого отдельного аналита, а также для всего мультиплексного анализа в целом.

В лаборатории требуется определить и исследовать необходимое количество образцов.

Примечание 1 - Необходимое для анализа количество образцов зависит от таких факторов, как сложность и точность анализа, распространенность мишени в указанной популяции, установленная точность референтного/сравнительного метода, схема, используемая для анализа статистических данных, приемлемый уровень статистической достоверности, а также затраты. Рекомендуется проводить исследование не менее 20 и - как правило - 40 - 50 и более образцов.

 

Верификация по оценке точности должна быть выполнена на клинических образцах (по возможности) в необходимом количестве, а распределение выборки должно быть репрезентативным для типов клинических образцов, подлежащих тестированию (например, кровь, плазма, стул, жидкости организма). Если доступных образцов не хватает для проведения анализа во всем аналитическом или заявленном диапазоне, то клинические или искусственные образцы, про которые известно, что они содержат определенное количество патогенов, могут быть разбавлены соответствующей матрицей без мишеней (например, образцы смешанной сыворотки или суспензии кала), а в эти образцы до проведения исследования может быть введен внутренний контроль.

Для определения правильности исследования лаборатории должны интерпретировать полученные данные как графически, так и статистически.

Для оценки данных сопоставления методов следует использовать как анализ диаграмм рассеивания с применением корреляционного и регрессионного анализа, так и диаграммы Блэнда-Алтмана с расчетом 95% предела согласия.

7.3.2.2 Исследования прецизионности

Исследования для определения прецизионности должны проводиться с использованием образцов с известной концентрацией аналита, если это применимо. Образцы должны быть отобраны или подготовлены в матрице, аналогичной матрице клинических образцов, насколько это возможно.

Материалы для исследования могут включать стандартные образцы, материалы контроля качества, образцы для проверки квалификации персонала или образцы пациентов в достаточном количестве для выполнения исследования.

Исследования прецизионности должны проверять повторяемость, внутрилабораторную прецизионность и воспроизводимость, если это применимо.

Повторяемость будет исследоваться путем повторного анализа одного и того же материала, с использованием одного и того же метода, одного и того же оборудования, одним и тем же оператором, в одной и той же лаборатории в течение короткого периода времени. Аналогичный подход используется для определения прецизионности в пределах партии/прогона теста или метода анализа.

Промежуточная прецизионность будет исследоваться путем повторного анализа одного и того же материала с использованием одного и того же метода, одного и того же оборудования, одним и тем же сотрудником, в одной и той же лаборатории в течение продолжительного периода времени.

Воспроизводимость будет исследоваться путем повторного анализа одного и того же материала в разных лабораториях с использованием одного и того же метода различными сотрудниками и/или различным оборудованием. Она также известна как межлабораторная воспроизводимость.

На исследования прецизионности лаборатория отводит достаточное время и количество образцов в соответствии с предусмотренным применением теста.

Исследования прецизионности должны проводиться в соответствии с программой исследования, статистическими рекомендациями и ИСО 15189.

Лаборатории должны учитывать и включать в программу исследования прецизионности возможные значимые причины вариации, такие как различные операторы, различные партии реагентов, различные приборы.

Для методов качественного анализа исследование прецизионности должно давать оценку непрецизионности метода при концентрациях аналита вблизи предела обнаружения.

В программу исследования должен быть включен анализ образцов в концентрациях, соответствующих всему динамическому диапазону метода: одного с концентрацией аналита на пределе обнаружения, другого с концентрацией на 20% выше предела обнаружения и следующего с концентрацией на 20% ниже предела обнаружения. Анализ таких образцов может выполняться повторно до 40 раз.

Для методов количественного анализа требуется включать в исследование прецизионности, по крайней мере, один образец с высоким уровнем, один образец с низким и образец, максимально приближенный к диагностически важной точке (обычно это предел обнаружения). Более высокие уровни вариации, как правило, находятся на нижней и верхней границах диапазона измерений. Если существуют большие различия в оценках прецизионности на трех уровнях, может возникнуть необходимость в проведении исследования с дополнительными концентрациями, чтобы полностью описать прецизионность результатов анализа.

Рекомендуется выстраивать прецизионность исследования так, чтобы было возможно рассчитать вариацию внутри повторяемости измерений, промежуточной прецизионности измерений и воспроизводимости измерений, и затем на их основе можно было определить общую вариацию анализа.

Прецизионность исследования должна быть выражена с помощью статистических показателей погрешности, таких как стандартное отклонение (СО) или коэффициент вариации (КВ).

Примечание 1 - Как правило, коэффициент вариации (КВ) выражается в терминах сигнального или измеренного (истинного) значения, которое будет давать оценки с заданным коэффициентом вариации (КВ, определяемый как отношение выборочной дисперсии s к среднему x и выражаемый в процентах).

 

Для анализа данных результаты прецизионности исследования должны оцениваться лабораторией в соответствии с документированными критериями приемки.

Погрешность часто выражается как целевое значение +/- 2 - 3 СО, или целевое значение +/- процент (например, целевое значение 10%). В общем случае точность вокруг среднего значения не должна превышать 15% от коэффициента вариации, за исключением нижнего предела количественного обнаружения, для которого точность не должна превышать 20%. При определении приемлемых показателей прецизионности рекомендуется строить графики, на которых СО или КВ представлены как функция от концентрации аналита.

7.4 Аналитическая чувствительность/предел обнаружения

Как для количественных, так и для качественных исследований лаборатории должны определять предел обнаружения как самую низкую фактическую концентрацию аналита в образце, которая может быть последовательно обнаружена с приемлемой точностью. При определении аналитической специфичности в лаборатории требуется проводить исследования перекрестной специфичности и интерференции.

К организмам, вызывающим перекрестную специфичность, могут относиться организмы, которые имеют с мишенью одну гомологию последовательностей; организмы, присущие нормальной флоре и которые могут одновременно присутствовать в образце; и организмы, которые вызывают сходные болезненные состояния или клинически значимые сочетанные инфекции.

При применении метода требуется проводить исследования интерференции путем анализа влияния потенциально интерферирующих веществ, добавляемых к образцам, содержащим целевую нуклеиновую кислоту (проверка на интерференцию).

Интерференция/перекрестная реактивность устанавливается для каждого типа образца, используемого в исследовании, с использованием потенциально интерферирующего материала, соответствующего матрице образца.

Для определения специфичности исследования анализ данных должен проводиться в соответствии с общепринятыми статистическими подходами, такими как: парный t-test критерий Стьюдента, проведение повторных измерений или определение попарных различий. Анализ основан на разнице между средними показателями, определенными для тестовых и контрольных образцов, и допустимой погрешностью, которая является клинически значимой для исследования.

Примечание 1 - Для количественных исследований возможно принять предел обнаружения равным пределу количественного определения. Это возможно в том случае, если наблюдаемое смещение и погрешность предела обнаружения удовлетворяют требованиям к общей погрешности для анализируемого вещества. Однако чаще всего предел обнаружения находится ниже линейного диапазона исследования и ниже предела количественного определения. Предел обнаружения не может быть выше предела количественного определения.

 

Лаборатории определяют предел обнаружения метода исследования эмпирическим путем с помощью серийных разведений образцов с известной концентрацией целевого вещества в аналитическом диапазоне ожидаемого предела обнаружения.

Аналитическая чувствительность должна быть определена для каждого типа матрицы образцов, исследования которых будут регулярно проводиться в клинической лаборатории.

Лаборатории также должны проверять аналитическую чувствительность для каждого генотипа, если это представляется необходимым.

Для определения предела обнаружения лаборатории должны проверить достаточное с точки зрения статистики количество проб.

В анализе данных лаборатории должны использовать пробит-анализ для эмпирического определения самой низкой концентрации мишени, которая может быть надежно обнаружена при помощи молекулярного анализа.

Пробит-регрессионный анализ показывает значения пробита (единицы вероятности), которые преобразуются в значения C95 (концентрации, обнаруживаемой в 95% образцов), которая показывает, что предел обнаружения составляет определенное количество копий/см³ (копий/мл) и что образцы, содержащие эту концентрацию, будут обнаружены в 95% тестируемых образцов.

В мультиплексных исследованиях предел обнаружения определяется для каждого аналита с использованием мультиплексного анализа.

7.4.1 Валидация исследования

7.4.1.1 Валидация отчета о результатах исследования

После сбора всех необходимых данных о валидации необходимо составить сводный отчет о валидации в лаборатории.

Этот отчет должен включать краткое изложение основных требований, полное описание используемого метода, четкое описание проводимых для валидации исследований и все полученные в их ходе результаты, подробно проанализированные.

В этом документе должны быть записаны все различные этапы рабочего процесса, которые были валидированы (например, этап предварительной экспертизы), используемые реагенты и условия, а также сотрудники, участвующие в исследовании. Этот документ будет включать критерии принятия/отклонения, подробную информацию о серии анализов/повторном анализе образца и некоторую информацию о клинической интерпретации результата исследования.

Ссылки на открытые источники должны быть приведены в дополнение к результатам местных исследований, проведенных в процессе валидации, и обоснования выводов, для которых потенциально могут отсутствовать прямые доказательства.

После завершения работы отчет должен быть оценен в соответствии с системой лабораторного менеджмента качества.

Результаты работы руководитель лаборатории должен заверить подписью и датой, что метод исследования готов (или не готов) к клиническому применению на практике.

Примечание 1 - В некоторых странах могут существовать юридические требования для регистрации лабораторных практик.

Примечание 2 - Руководство по регистрации как производителей, так и для лабораторий, приведены в ИСО/МЭК 17050-1 и ИСО/МЭК 17050-2.

 

Валидация исследования - разовое мероприятие, не требующее повтора, пока условия, в которых был разработан метод, не изменяются. Повторная валидация должна проводиться лабораторией, если существующий метод каким-либо образом модифицирован.

Примечание 3 - Модификации могут включать добавление возможности использовать новые типы образцов или изменения в критическом компоненте или реагенте, которые могут повлиять на результаты исследования.

 

7.4.1.2 Дополнения к валидации

Дополнительная валидация может быть выполнена, если в метод исследования, который уже был полностью валидирован, были внесены незначительные изменения (в зависимости от их степени), которые не меняют принцип метода. Например, если меняется устройство для сбора или контейнер для того же типа образца и ожидается, что это не окажет существенного влияния на сам образец - в таком случае требуется лишь минимальная валидация, включающая проведение испытания на точность и прецизионность на ограниченном числе образцов (например, 5 - 10).