ГОСТ ISO 10993-4-2020. Межгосударственный стандарт. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 4. Исследования изделий, взаимодействующих с кровью

Приложение F

(справочное)

 

МЕНЕЕ РАСПРОСТРАНЕННЫЕ МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

 

F.1 Общие положения

Настоящее приложение и таблица F.1 описывают методы исследований, которые применяли в основном для оценки взаимодействия МИ/материала с кровью, но их широко не использовали для целей регистрации МИ. Методы исследований представлены в справочных целях с оговоркой, что они не могут быть стандартизированы или коррелированы с их клиническим применением. Так как стратегия доклинической оценки биологической безопасности МИ должна быть концентрирована на применении наиболее значимых и широко принятых методов тестирования (см. приложение B), рекомендуется проявлять осторожность при включении каких-либо методов из приложения F в регистрационные заявки. Методы лабораторных исследований, которые не рекомендуется применять, приведены в приложении G.

 

Таблица F.1

 

Менее распространенные методы лабораторных исследований

для оценки взаимодействия МИ с кровью

 

Категории исследований <a>
Тромбоз	Снижение потока, гравиметрический анализ, перепад давления в изделии, анализ адсорбированного белка, методы визуализации
Тромбоз in vitro
Активация системы свертывания крови	Генерация тромбина с использованием хромогенных субстратов, продукты деградации фибриногена и фибрина (ПДФ), D-димер
Тромбоциты	Оценка количества адгезированных тромбоцитов, метод проточной цитометрии для исследования активации тромбоцитов, формирование микрочастиц тромбоцитов, гамма-визуализация тромбоцитов, меченных радиоизотопами, агрегация тромбоцитов
Гематология	Проточная цитометрия, активации лейкоцитов, оценки адгезии клеток крови, комплексы тромбоцит-лейкоцит (PLC)
Система комплемента	Концентрация компонентов Bb, C3bBb, C5a
<a> Из-за биологической вариативности крови и технических ограничений точность и информативность многих из этих исследований, которые наиболее часто используют в научных целях, требуют тщательного внимания к методологии и осторожности при интерпретации результатов.

 

F.2 Тромбоз

F.2.1 Снижение потока крови

Параметры потока (скорость или объем) измеряют после определенного интервала времени испытания изделия. Измерения допускается выполнять как во время проведения эксперимента, так и до и после его окончания. Обоснование и интерпретация результатов в соответствии с B.2.1.

F.2.2 Гравиметрический анализ (масса тромба)

Измерение проводят после удаления МИ с места имплантации. Обоснование и интерпретация результатов представлены в B.2.1. Разница между массой реимплантированного (после удаления) МИ и его массой до имплантации может отразить количество образовавшегося тромба. Следует учитывать, что не вся разница в массе может быть массой образовавшегося тромба.

F.2.3 Перепад давления в изделии

Перепад давления в МИ измеряют до и после исследования.

F.2.4 Анализ адсорбированного белка (метод связывания антител)

Адсорбция белка на исследуемые материалы или изделия, которая происходит сразу после контакта с кровью; например, первый слой или поверхностный слой при достижении равновесия считают потенциально влияющим на функционирование изделия и/или результат его клинического применения. После качественной микроскопической оценки образования фибрина и отложения тромбоцитов на поверхности материалов возможна количественная оценка адсорбированного белка путем измерения количества меченых антител, специфических к таким белкам, как фибриноген или рецепторы мембраны тромбоцита. После контакта с кровью материалы сначала отмывают физиологическим раствором для удаления слабо адсорбированных белков и компонентов крови. Затем поверхность материалов или экстракты с поверхностей инкубируют с мечеными антителами для качественного или количественного анализа. Дополнительно возможно измерение общего количества адсорбированного белка напрямую без использования антител [164], [181] - [183].

F.2.5 Методы визуализации. Ангиография, внутрисосудистый ультразвук, доплеровский ультразвук, КТ и МРТ

Возможен выбор среди этих методов для определения проходимости или степени сужения имплантата или кондуита и для обнаружения отложения тромба на изделиях во время их функционирования in vivo.

F.3 Свертывание крови

F.3.1 Оценка образования тромбина с использованием хромогенных субстратов

В присутствии фосфолипидов материалы, находящиеся в контакте с интактной системой свертывания крови, будут инициировать генерацию тромбина, который возможно измерить конверсией хромогенного субстрата [61] - [63].

F.3.2 Продукты деградации фибриногена и фибрина (ПДФ)

При нормальном физиологическом фибринолизе продуцируется ПДФ X, Y, C, D и E в концентрациях менее 2 мг/мл плазмы. Как правило, низкий уровень ПДФ поддерживается низкой скоростью реакции деградации и высокой скоростью выведения ПДФ из кровообращения. В результате повышенной активации плазминогена при патологической деградации фибрина и фибриногена образуется ПДФ от 2 до 40 мг/мл или более [64]. Исследование в основном полезно для оценки гемосовместимости имплантируемых МИ. Рекомендуется применять коммерчески доступные методы, такие как ИФА.

При дисфибриногенемии, афибриногенемии и гипофибриногенемии наблюдается увеличение значений ПВ, ЧТВ и ТВ [45].

F.3.3 D-димер

Повышенный уровень D-димера указывает на активацию механизма свертывания крови. D-димеры являются продуктами деградации плазмином перекрестно-связанного фибрина FXIII (коагуляция и фибринолиз). Рекомендуется применение ИФА и/или пробы РИА для количественного измерения данных белков [65], [66].

F.4 Тромбоциты

F.4.1 Оценка адгезии тромбоцитов

Адгезия клеток крови [167] является измерением гемосовместимости материала при рассмотрении в сочетании с дистальной эмболизацией или признаками активации одного или более гематологических факторов.

Разработаны различные методы для измерения адгезии клеток на поверхности, например К-баллы Куники [75]. Большинство из методов основаны на том, что определенная часть тромбоцитов удаляется из нормальной цельной крови в результате прохождения ее через колонку со стеклянными шариками при контролируемых условиях потока или давления.

Альтернативным методом является прямой подсчет адгезированных на поверхности тромбоцитов. После контакта с кровью или плазмой, обогащенной тромбоцитами, при стандартизированных условиях тестируемую поверхность отмывают от неадгезированных клеток, фиксируют и готовят для световой микроскопии или РЭМ. Подсчитывают количество адгезированных тромбоцитов на единицу площади с анализом их морфологии (например, количество распределения, степень формирования агрегата). В качестве альтернативы допускается использовать тромбоциты, заранее меченные 51Cr или 111In [70] - [73]. Выявлено, что альтернативный неизотопный метод, ЛДГ и методы кислой фосфатазы, которые оценивают активность ферментов в целом, после лизиса адгезированных тромбоцитов тоже являются ценными инструментами для исследования процессов адгезии тромбоцитов на поверхности [83], [84].

F.4.2 Анализ активации тромбоцитов методом проточной цитометрии

Применение ряда МИ может привести к активации тромбоцитов или появлению микрочастиц тромбоцитов [173]. Маркеры поверхностной активации тромбоцитов оценивали проточной цитометрией на экспрессию P-селектина (ГМП-140) или экспрессию активированного гликопротеина Ib и IIB/IIIa, используя моноклональные антитела. Различные эпитопы активированных тромбоцитов распознают методом проточной цитометрии, используя два антитела: одно специфичное к тромбоцитам (т.е. ГП Ib или ГП IIb/IIIa) и другое специфичное к активации тромбоцитов (P-селектин) [69].

F.4.3 Гамма-визуализация радиомеченых тромбоцитов

Сильное гамма-излучение 111In позволяет использовать его для визуализации тромбоцитов [46], [47], [50], [72]. Методом определяют распределение адгезированных тромбоцитов и их число на поверхности. Метод применяют для исследования МИ, присоединяемых извне, и имплантируемых МИ.

F.4.4 Агрегатометрия

Агрегация тромбоцитов [74] индуцируется добавлением агентов (например, АДФ, эпинефрин, коллаген и тромбин), вызывающих индуцированную агрегацию, к плазме, обогащенной тромбоцитами (ПОТ), при непрерывном ее перемешивании. По мере агрегации тромбоцитов и седиментации их агрегатов плазма постепенно становится прозрачнее. Оптическую систему (агрегометр тромбоцитов) применяют для обнаружения изменений в светопропускании, а записывающее устройство графически записывает изменение интенсивности проходящего света по сравнению с исходным значением. Замедленная или сниженная агрегация тромбоцитов может быть вызвана активацией тромбоцитов и высвобождением тромбоцитарных гранул, повышенным АДФ или некоторыми лекарствами (например, ацетилсалициловой кислотой или нестероидными противовоспалительными средствами). Интенсивность индуцированной агрегации тромбоцитов зависит от вида животных вплоть до ее отсутствия. Спонтанная агрегация тромбоцитов, проходящая без добавления агонистов, является абнормальным явлением, указывающим на активацию тромбоцитов. Агрегаты тромбоцитов могут быть обнаружены методом WU/HOAK [79].

F.5 Гематология

F.5.1 Состояние и морфология лейкоцитов

Степень активации лейкоцитов измеряют методом проточной цитометрии по увеличению маркеров лейкоцитов, таких как L-селектин и CD 11b, и по изменению количественного распределения в субпопуляциях лимфоцитов. Допускается оценивать активацию лейкоцитов по морфологическим изменениям, которым лейкоциты подвергаются при активации на поверхности МИ. Как правило, для этого применяют метод РЭМ [173].

F.5.2 Оценки адгезии клеток крови

Адгезия клеток крови [167] при комбинированном исследовании с процессами эмболизации дистальных органов или признаками активации одного или более гематологических факторов является одним из показателей гемосовместимости материала/изделия. С использованием такого метода [167] было установлено, что адгезия выделенных из крови периферических лимфоцитов собаки и полиморфоядерных лейкоцитов к стеклянным шарикам, покрытым поли(гидроксиэтилметакрилатом) (pHEMA), ниже, чем к шарикам, покрытым полистиролом и некоторыми другими полимерами.

F.5.3 Комплексы тромбоцит-лейкоцит (PLC)

Образование комплексов PLC может быть измерено методом проточной цитометрии, и их количество может служить индикатором активации лейкоцитов и тромбоцитов после контакта МИ и материалов [85].

F.6 Система комплемента

F.6.1 Оценка активации комплемента по фрагментам Bb, C3bBb и C5a

Из этих трех белков компонентов комплемента фрагмент C5a считают одним из наиболее критичных факторов комплемента при активации комплемента во время контакта изделия с кровью [145]. Тем не менее рутинный тест на наличие C5a не является необходимым, учитывая низкую чувствительность коммерчески доступных наборов ИФА для обнаружения данного белка in vitro.