ГОСТ ISO 10993-4-2020. Межгосударственный стандарт. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 4. Исследования изделий, взаимодействующих с кровью

Приложение E

(справочное)

 

СИСТЕМА КОМПЛЕМЕНТА. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

 

E.1 Исходные данные

Активацию системы комплемента связывают с наблюдаемыми в некоторых случаях в клинической практике отрицательными реакциями при экстракорпоральных методах лечения, особенно при гемодиализе [129] - [132] и искусственном кровообращении [133] - [136]. Как правило, при такой терапии применяют МИ с большими площадями поверхности контакта с кровью и относительно короткими периодами контакта. Активация комплемента, как правило, происходит на ранней стадии, вскоре после контакта крови с поверхностью МИ; до сих пор нет сообщений о ее активации на поздних сроках контакта. Выявлено, что активация системы комплемента при контакте крови с материалом/МИ обусловлена адсорбцией целого ряда белков плазмы, включая ключевые белковые компоненты системы комплемента C3 и C3b (C3b·Bb, C3b·C3b·Bb соответственно; см. рисунок B.2). Белок конвертазы C5 катализирует расщепление C5, приводящее к выработке C5a и C5b. Белок C5a является известным эффектором опосредованной рецепторами активации нейтрофилов и моноцитов, а фрагмент C5b - признанным начальным компонентом комплемента, участвующего в формировании мембраноатакующего комплекса (МАК) комплемента, который связывается с клетками крови, что приводит к их активации и/или лизису. Лейкоциты могут взаимодействовать с фрагментами C3 и C4 при их адсорбции на поверхности материала с последующей адгезией к поверхности и активацией клеток. Активация нейтрофилов и моноцитов, формирование и активность МАК, адгезия и активация лейкоцитов на поверхности материалов являются причиной архетипической патофизиологии, наблюдаемой при клиническом применении изделия с большой площадью поверхности [136]. В [138] приведена критическая роль фрагмента C5a как медиатора во многих из этих отрицательных реакций. Дозозависимые ответы, идентичные ответам при настоящем диализе, наблюдались в имитированном гемодиализе и инфузии очищенного C5a. Дальнейшие исследования в этой области показали, что материалы, поверхности которых являются сильно нуклеофильными (гидроксил- и аминсодержащими), имеют наибольшую способность к активации комплемента, а различные изменения поверхности, которые уменьшают ее электроноизбыточность/нуклеофильность, значительно нивелируют классические клинические проявления активации системы комплемента. Данный вывод поддерживается другими исследователями, изучающими взаимоотношение активации комплемента материалами для МИ и биологического ответа на чужеродную поверхность [136], [137].

Вывод о том, что гидроксил- и аминсодержащие группы на поверхности МИ при контакте с кровью приводят к активации системы комплемента, стимулировал разработку новых материалов, в которых этих химических групп не было или они были заблокированы. Подобное изменение химических свойств поверхности материалов существенно уменьшило активацию комплемента для МИ с большей площадью поверхности и кратковременным контактом. Такое внимание к активации комплемента МИ с большой площадью контакта с кровью послужило стимулом для разработки методов модифицирования для снижения активации системы комплемента для всех МИ, вне зависимости от их площади поверхности и длительности контакта с кровью. В настоящее время рабочая группа (the Working Group) не выявила каких-либо научных работ или клинических отчетов об отрицательных событиях, связанных с активацией системы комплемента МИ средней и малой площадью поверхности. Таким образом, в настоящее время отсутствуют соответствующие новые ссылки, которые связывают активацию комплемента и последующие отрицательные реакции пациента при контакте крови с МИ в зависимости от площади поверхности. Следует отметить, что при применении МИ наблюдаются классические анафилактические реакции. Причиной этих реакций скорее являются используемые препараты, чем МИ или материалы изделия [139] - [142]. Некоторые ложные выводы об активации системы комплемента с исследуемыми МИ могли возникнуть в результате таких отчетов [143].

Как и при оценке активации системы свертывания крови, процессов тромбообразования и активации тромбоцитов, существует несколько методов молекулярной биологии (например, ИФА) для мониторинга уровня активации пути комплемента в крови. Примеры белков комплемента, для которых существуют коммерчески доступные комплекты ИФА, включают, но не ограничиваются фрагментами C3a, C5a и SC5b9. Несмотря на сильную связь опосредованной комплементом патофизиологии с фрагментом C5a, классическое исследование комплемента сконцентрировалось на оценке фрагмента компонента C3a и комплекса SC5b9. Совокупно с этими возможностями существуют методы оценки связанных с активацией системы комплемента ответов, таких как адгезия лейкоцитов (используя РЭМ) и активация лейкоцитов (например, используя биопробы для оценки высвобождения эластазы из полиморфоядерных лейкоцитов (ПМЯ)).

E.2 Исследования активации комплемента и документация (рекомендуется при составлении отчета о результатах исследования комплемента в научных или нормативных целях)

Общие методы и документация, используемые при исследовании активации системы комплемента методом ИФА, приведены в B.4.

Как и другие биологические реакции, такие как активация белков свертывающей системы крови, активация компонентов системы комплемента, как правило, состоит из фазы инициации, развития и окончания [56], [57], [137]. Это отражает начальные реакции формирования конвертазы C3 и C5, амплификацию каскада обратной связи и период замедления/деактивации, когда критичные прекурсоры могут быть израсходованы или активированные белки могут потерять активность из-за короткого периода полураспада или деактивации посредством белков обратной связи отрицательного контроля. Так, ожидаются различия в уровнях белков комплемента в порядке их каскадной активации. Как следствие конкретная фаза каскадной активации системы комплемента во время непосредственного контакта материала/изделия с кровью является важным фактором. То есть влияние исследуемых материалов на активацию системы комплемента при инкубации с кровью может быть достаточно различным для каждой из фаз. Кроме того, так как активация комплемента в основном пропорциональна площади поверхности, контактирующей с кровью, площадь поверхности (ПП) изделия или материала изделия может сильно влиять на результаты измерений. По этой причине значение экспозиционной дозы - отношение ПП к объему крови (цельной, плазмы или сыворотки) должно быть приведено в каждом исследовании. Если допустимо, значение экспозиционной дозы может варьироваться для понимания специфичности эффекта материала. Значения экспозиционной дозы от 3,0 см² до 6,0 см²/мл крови (основываясь на толщине изделия) соответствуют значениям, установленным в ISO 10993-12. Другие значения экспозиционной дозы, такие как больше данного отношения в 1,5 и 2,0 раза, допускается использовать, так как более высокие значения площади поверхности теоретически увеличат чувствительность ответа на исследуемый материал.

Примечание - Существует физическое ограничение на количество тестируемого материала, которое может быть испытано, что связано с объемом тест-системы, например пробирки и заданного значения экспозиционной дозы.

 

E.3 Методы исследования активации системы комплемента

Анализ существующих многочисленных методов для оценки активации системы комплемента в исследовательских лабораториях показал, что наибольшее распространение получило использование коммерческих тест-наборов. Тем не менее установлен ряд различий между лабораторными методами, которые перечислены ниже.

a) Кровь и антикоагулянты: кровь, используемая для инкубации с исследуемым материалом, значительно различалась между лабораториями. Например, использовали коммерчески доступную сыворотку человека, свежую и замороженную цитратную плазму человека, свежую сыворотку и свежую гепаринизированную цельную кровь человека. Влияние этих различных биологических сред на результаты активации комплемента не исследовано, за исключением применения ЭДТК/EDTA в качестве антикоагулянта. Хорошо известно, что активация комплемента классическим путем зависит от содержания кальция, а альтернативным путем - от магния. Таким образом, применение мощных хелаторов кальция/магния, таких как ЭДТК, свяжет свободный кальций и магний и отключит активацию комплемента, что сделает большинство измерений с использованием этих антикоагулянтов близкими к базовым уровням белков комплемента.

Учитывая вышесказанное, в настоящее время нет стандартов для крови или препаратов крови для применения в испытаниях на комплемент. Тем не менее при использовании сыворотки сыворотка должна быть функционально интактна и сохранять способность к активации комплемента. Если используют цельную кровь или плазму, следует тщательно выбирать такой тип антикоагулянта, который не ингибирует или не стимулирует активацию системы комплемента, индуцированную изделием.

b) Отношение площади поверхности исследуемого объекта к объему крови (цельная, плазма или сыворотка): в ряде лабораторий используют значение отношения площади к объему крови (цельной, плазмы или сыворотки), рекомендуемое ISO 10993-12 для экстракта. Некоторые лаборатории не уточняют это значение и/или применяют, в зависимости от вида материала/МИ, различные значения. Так как на активацию комплемента влияет площадь поверхности (ПП), то стандартизированные и записанные в отчете значения ПП важны для межлабораторных и внутреннего контролей результатов и их интерпретации.

c) Применение контролей: использование полимерных материалов в качестве отрицательного (таких, как полипропилен, полиэтилен) и положительного (например, латекс или ацетат целлюлозы) контролей, относительно правомочно. Использование жидких отрицательного (раствор солей) и положительного (компонент яда кобры) контролей не корректно. Использование отрицательного и положительного контролей, предоставляемых в коммерчески доступных комплектах, относительно правомочно.

d) Активация комплемента МИ, контактирующими с кровью, признана феноменом поверхности. В связи с этим исследование с экстрактом МИ не является допустимым. Исследование активации комплемента МИ/материалом всегда следует проводить методом прямого контакта с кровью или ее компонентами. Материал отрицательного контроля, такой как полиэтилен (ПЭ), должен быть включен в исследование вместе с материалом положительного контроля, таким как немодифицированная целлюлоза, например Cuprophan <2> (если доступен). Соответственно, применение жидкого отрицательного контроля, такого как раствор солей, не является подходящим отрицательным контролем для тестирования активации комплемента поверхностью МИ. С другой стороны, мощный жидкий активатор комплемента, такой как компонент яда кобры, может быть использован для демонстрации работы тест-системы при условиях данного эксперимента.

--------------------------------

<2> Cuprophan является примером коммерчески доступного продукта. Эта информация приводится для удобства пользования настоящим стандартом и не является поддержкой ISO указанного продукта.

 

e) Подготовка калибровочной кривой/разведения: лаборатории использовали различные разбавления стандарта для выработки стандартной кривой, которая охватывает большинство уровней исследуемых и контрольных образцов. Например, в зависимости от активности комплемента используют разбавления 1:100, 1:200, 1:1000 и 1:10 000. Самым важным фактором является то, что все образцы в итоге находятся между низким и высоким показателями активности системы комплемента на калибровочной кривой.

f) Время инкубации для исследуемых объектов и контролей: время инкубации образцов материалов с кровью (плазмой, сывороткой) различалось между лабораториями и составляли 60, 90 или 30, 60 и 90 мин.

g) Время инкубации после добавления хромогенного субстрата: в отчетах приведены значения от 15 до 30 мин.

h) Оценка исследуемого образца: метод оценки, используемый в лабораториях (получен положительный или отрицательный результат), был различен. Большинство лабораторий проводили сравнительный статистический анализ результатов исследуемого образца с положительными и отрицательными контролями полимерных материалов и/или жидкими контролями. Некоторые лаборатории включали сравнение с историческими/существующими значениями с результатами для изделия-аналога и/или особую математическую формулу, включающую отрицательные и положительные контроли как часть конечной оценки.

Не существует установленного критерия приемлемого уровня активации комплемента изделием для принятия решения его клинического применения. Включение коммерческого изделия как образца сравнения при исследовании активации системы комплемента исследуемым изделием/материалом будет полезным для интерпретации полученных результатов. Результаты, полученные для коммерческих изделий, могут быть использованы для оценки клинической пригодности исследуемого МИ.

Если МИ сравнения не продается легально в данном регионе, в котором осуществляют регистрацию исследуемого изделия, то местные регулирующие органы могут затребовать проведение исследования этого МИ сравнения вместе с регистрируемым МИ.