ГОСТ ISO 10993-4-2020. Межгосударственный стандарт. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 4. Исследования изделий, взаимодействующих с кровью

Приложение D

(справочное)

 

ГЕМАТОЛОГИЯ/ГЕМОЛИЗ. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ОЦЕНКА ГЕМОЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЕДИЦИНСКИХ ИЗДЕЛИЙ

И МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ МЕДИЦИНСКИХ ИЗДЕЛИЙ

 

D.1 Общие положения

Настоящее приложение содержит обзор известных методов исследования гемолиза с последующим обсуждением вопросов, относящихся к возможности этих методов охарактеризовать гемосовместимость медицинских материалов/МИ. Гемолиз является временной функцией воздействия материала на кровь и крови на свойства материала, как поверхностная энергия, морфология поверхности и химия поверхности. Гемолиз является функцией местных механических сил и биохимических факторов.

D.2 Причины гемолиза

D.2.1 Осмотическое давление (гемолиз, индуцированный осмотическим давлением)

Мембрана эритроцита является полупроницаемой мембраной. Перепад давления возникает, когда такая мембрана разделяет два раствора с различными концентрациями. Осмотическое давление происходит, когда мембрана непроницаема для пассивного движения раствора, но позволяет проход чистого растворителя, такого как вода. Такой перепад давления может вызвать разбухание эритроцитов и разрыв клеточной мембраны с выделением свободного гемоглобина [175]. Осмотическая резистентность может варьироваться среди эритроцитов млекопитающих [95] - [98].

D.2.2 Механические факторы (гемолиз, индуцированный механическим воздействием)

Динамические факторы жидкой среды: скорость кровотока, турбулентность и нефизиологические силы сдвига - могут деформировать мембрану эритроцита и потенциально вызвать разрыв мембраны. Последнее может быть потенциально усугублено изделиями с механическим управлением и/или сложными путями потока. Примерами МИ являются:

- системы афереза и сепарации клеток;

- фильтры артериальной крови [11], [36];

- насосы вспомогательного кровообращения [29], [30], [124], [157];

- системы искусственного кровообращения [5], [10], [11], [13], [37], [41];

- системы кардиотомии/венозного резервуара [10], [11];

- устройства поддержания кровообращения [9];

- системы гемодиализа [16], [28], [41];

- механические клапаны сердца [2];

- искусственные желудочки сердца [236], [237].

D.2.3 Биохимические факторы (гемолиз, индуцированный материалом)

Изменения структуры мембраны на молекулярном уровне могут повлиять на прочность и эластические свойства мембраны эритроцита. Недостаток питательных веществ или метаболической энергии (АТФ) может привести к потере дискообразной формы и микровезикуляции гемоглобина. Другие агенты, например экстрагируемые из МИ, бактериальные токсины, pH и изменения в метаболизме, индуцированные температурой, способны также повредить мембрану эритроцита [95]. Эти изменения могут вызвать разрыв мембраны при осмотических давлениях ниже критического значения. Целесообразно провести предварительное исследование для определения критического значения давления, при котором мембрана эритроцита разрывается (осмотическая резистентность).

D.3 Клиническая значимость гемолиза

D.3.1 Токсические эффекты

Повышенные уровни свободного гемоглобина могут спровоцировать токсические эффекты или инициировать процессы, которые способны вызвать нагрузку на почки или другие органы [175]. Концентрация свободного гемоглобина является информативным параметром, характеризующим степень повреждения эритроцитов, а также косвенным индикатором повреждения мембраны других элементов крови.

D.3.2 Тромбоз и анемия

Внутрисосудистый гемолиз способствует тромбозу из-за каскада событий, включающих высвобождения АДФ из эритроцитов и фосфолипидов [106], с последующей активацией тромбоцитов и дегрануляции протромботических агентов. Когда гемолиз вызывает клинически значимое снижение количества эритроцитов, это может привести к анемии и нарушению способности переноса кислорода с последующим отрицательным действием на мозг и другие органы или ткани.

D.4 Оценка достоверности результатов гемолитического исследования

Величина гемолиза зависит от времени контакта материала с кровью и от свойств самого материала, таких как энергия, морфология и химический состав поверхности. Гемолиз также может быть обусловлен функцией напряжения сдвига кровотока, взаимодействием с мембраной клетки, характером слоев адсорбированных белков, стабильностью потока, наличием пузырьков воздуха и варьируемыми характеристиками самой крови (источник, возраст донора и биохимический состав) [108], [112], [113]. Эти переменные следует адекватно контролировать для сравнения гемолитической активности материалов и МИ. Спектр методов оценки гемолиза варьирует от упрощенных до очень сложных моделей. Известен ряд моделей in vitro и in vivo для проведения теста в потоке крови. Значения гемолитической активности являются параметрами сравнения относительно материалов или МИ, исследуемых на той же модели в конкретной лаборатории, а не абсолютными величинами. Методы исследования in vitro способны количественно выразить малые концентрации гемоглобина плазмы, который может быть неизмерим в условиях in vivo (например, из-за связывания гемоглобина плазмы с гаптоглобином и быстрого удаления из организма). Допустимы методы определения концентрации лактатдегидрогеназы и гаптоглобина как индикаторов гемолиза в условиях исследования in vivo.

Невозможно определить универсальный уровень для приемлемых и неприемлемых значений гемолиза для всех МИ и возможных их применений. Гемолитическая активность МИ может быть в начальный период замаскирована травмой от хирургической процедуры. МИ может вызвать значительный гемолиз, но может являться единственным возможным способом лечения в ситуации с угрозой для жизни. Следует учитывать, что гемосовместимый материал не является гемолитическим. На практике многие МИ могут вызвать гемолиз, но их преимущество при клиническом использовании перевешивает риск, связанный с этим отрицательным воздействием на кровь. Следовательно, если МИ вызывает гемолиз, следует подтвердить, что МИ предоставляет клиническое преимущество и что гемолиз находится в клинически допустимых пределах. Критерий допустимости основан на какой-либо форме оценки риска и выгоды. Следующие вопросы являются предложениями для разработки такой оценки:

- Какова длительность воздействия МИ на пациента?

- Какой уровень гемолиза вызывает материал или МИ? Продолжается гемолиз весь период времени воздействия МИ на пациента? Продолжается гемолиз после удаления МИ?

- Каковы относительные риски и преимущества других существующих методов лечения?

- Каковы гемолитические свойства этих известных методов лечения? Как данное МИ сопоставляется с этими другими методами?

- Насколько эффективно исследуемое МИ по сравнению с другими формами лечения? Более эффективное МИ может вызвать значительный гемолиз во время использования, но эффективность применения МИ приносит большую пользу для пациента, чем другие способы лечения.

D.5 Исследование гемолиза. Общие положения

D.5.1 Методы

D.5.1.1 Общие положения

Гемолиз эритроцитов исследуют in vitro. Прямыми методами определяют гемолиз путем физических и химических взаимодействий исследуемого материала с эритроцитами. Непрямыми методами определяют гемолиз посредством веществ, экстрагируемых из исследуемых объектов. [17] является стандартом непосредственно по исследованиям гемолитических свойств материалов (в основном обусловленных химическими факторами), зависящих от размера изделия и его сложности. Настоящий стандарт не применим для исследования гемолитической активности целых, неповрежденных МИ. В [17], [22] и [28] приведены примеры методологий, конкретно разработанных для исследования гемолиза МИ и составляющих их материалов. Разработан стандарт [20] для оценки гемолиза, вызванного наночастицами медицинского назначения. В своей простейшей форме, при контакте сильно разбавленных суспензий эритроцитов с исследуемыми материалами, значения гемолиза, как правило, вычисляют как процентное содержание гемоглобина, который был высвобожден в супернатант относительно общего количества гемоглобина в данной суспензии клеток, т.е. значение концентрации свободного гемоглобина/концентрации общего гемоглобина, умноженное на 100%. Если все эритроциты суспензии разрушены, то наблюдается 100%-ный гемолиз.

В дополнение к исследованию материалов, входящих в состав изделий, необходимо провести испытания целых МИ для оценки влияния на гемолиз структуры изделия, физико-механических взаимодействий крови с материалами, с учетом диапазона условий клинического применения изделий (например, скорость кровотока, обороты в минуту, давление, время функционирования), назначения изделий и гемодинамических факторов. Гемолитическая активность многих изделий, вызванная гемодинамическими силами и взаимодействием с поверхностями в условиях потока, превышает значения гемолиза, вызванного химическими свойствами материалов. Для адекватной имитации условий клинического применения при исследовании гемолитического потенциала изделий в условиях потока следует учитывать гематокрит крови и другие факторы [30], [37], [41], [124]. Для определения наиболее возможного максимального значения гемолиза для данного изделия испытания in vitro, как правило, проводят при самой высокой скорости кровотока, для которой, как ожидается, будет использовано тестируемое изделие. Ссылки на документы, в которых представлены протоколы при исследовании гемолиза, индуцированного механическими воздействиями, включают ссылки на [5], [37], [41] и [124].

Концентрация гемоглобина в плазме значительно ниже, чем общая концентрация гемоглобина в крови. Концентрация свободного гемоглобина in vivo, как правило, составляет от 0 до 10 мг/дл, в то время как нормальный диапазон общей концентрации гемоглобина в крови составляет от 11000 до 18000 мг/дл. По этой причине применялись различные методы для измерения широкого диапазона концентраций гемоглобина, которые могут встречаться в течение исследования гемолиза.

ВНИМАНИЕ - Некоторые используемые методы оценки гемолитического действия изделий предлагают допустимый уровень гемолиза, индуцированного материалом, ниже которого риск не существует или низок, основываясь на исторически принятых и не валидированных показателях [14], [17], [28]. Тем не менее более высокие приемлемые уровни гемолиза, индуцированного материалом, могут быть обоснованы исходя из соответствующего анализа риск/польза.

Исследователи должны отдавать себе отчет в том, что на гемолиз могут негативно влиять химические вещества в медицинских материалах или растворах, которые могут изменять осмотическую резистентность эритроцитов (например, отдельные буферы и стабилизаторы, такие как формальдегид или глутаральдегид), вызывать преципитацию гемоглобина (например, ионы меди или цинка) или изменять спектр абсорбции гемоглобина (например, полиэтиленгликоль или этанол) [115], [170].

D.5.1.2 Измерения общей концентрации гемоглобина в крови

Аналитические методы, приведенные в D.5.1.2.1 и D.5.1.2.2, классически применялись для определения общих концентраций гемоглобина (Hb) в крови [106]. Общая концентрация гемоглобина в крови также может быть измерена калиброванными счетчиками клеток крови и гемоглобинометров.

D.5.1.2.1 Гемоглобинцианидный метод

Первый классический метод - цианметагемоглобиновый анализ был опубликован Международным комитетом по стандартизации в гематологии [121]. Цианметагемоглобиновый (гемоглобинцианид; HiCN) анализ достаточно удобен, прост для автоматизации и имеет внутренний стандарт сравнения (HiCN). Метод основан на окислении гемоглобина с последующим формированием гемоглобинцианида, который имеет широкий максимум поглощения при 540 нм. Применяют лизирующие агенты, такие как детергенты, которые, в дополнение к высвобождению гемоглобина из эритроцита, снижают мутность (источник помехи как ложная поглощаемость при 540 нм) от преципитации белка. Для общей концентрации гемоглобина спектральные помехи из-за плазмы минимальны и поглощаемость образца может быть напрямую сравнена со стандартным раствором HiCN.

Широкая полоса поглощения (абсорбции) HiCN в этой области позволяет использовать простые фотометры с набором фильтров, а также узкополосные спектрофотометры для ручного или автоматического обнаружения. Применение сравнительного стандарта HiCN предоставляет возможность сопоставлять результаты, полученные разными лабораториями, использующими этот метод. Главным недостатком является потенциальный риск для здоровья при использовании растворов цианида, так как цианореагенты при закислении выделяют HCN. Утилизация реагентов и отходов также связана со значительными трудностями и затратами.

D.5.1.2.2 Определение гемоглобина по концентрации железа

Второй классический метод определения общей концентрации гемоглобина основан на определении концентрации железа гемоглобина в растворе. Железо сначала отделяют от гемоглобина, как правило, кислотой или сжиганием пробы. Затем его титруют с TiCl₃ или соединяют с реагентом для окрашивания, интенсивность которого может быть измерена фотометрическим методом. Данный способ слишком сложен для обычной работы и редко применим.

D.5.1.3 Измерения концентраций гемоглобина в плазме или в супернатанте

Следующие два метода использовались для измерения концентраций гемоглобина в плазме или в супернатанте.

D.5.1.3.1 Прямые оптические и дополнительные химические методы

Из-за многих различных факторов (например, традиция, простота применения и утилизация химических отходов, наличие стандартных растворов) существует множество различных способов для измерения гемоглобина в плазме в качестве индикатора гемолиза, притом что ни один метод широко не применяют. Методы подразделяют на две категории:

- прямые оптические методы, т.е. основанные на измерении пика поглощения оксигемоглобина при 415, 541 или 577 нм напрямую (на фотоколориметре) или по спектрам поглощения в видимой области на спектрофотометре;

- дополнительные химические методы, т.е. измерение концентрации гемоглобина, основанное на химической реакции с реагентами, такими как бензидин-подобные хромогены и перекись водорода, или формировании цианмета гемоглобина [109]. Все эти исследования могут быть выполнены вручную или автоматически.

Популярный метод определения концентрации гемоглобина основан на его каталитическом эффекте окисления производного бензидина, такого как тетраметилбензидин, перекисью водорода. Скорость формирования окрашенного продукта (обнаруживаемого фотометрически при 600 нм) прямо пропорциональна концентрации гемоглобина. Преимуществами этого метода являются простота автоматизации (коммерческое оборудование), исключение потенциально токсичных и экологически опасных цианореагентов и наличие наборов стандартов гемоглобина, калиброванных против основных сравнительных стандартов HiCN. Пределы обнаружения пробы (такие низкие, как 5,0 мг/дл) сопоставимы с гемоглобинцианидным методом [106]. Основными недостатками являются потенциальный риск для здоровья при использовании бензидиновых красителей и расходы, связанные с утилизацией реагентов и отходов. Сообщаемый динамический диапазон этого метода низок (от 5 до 50 мг/дл) [116], и возможное ингибирование реакции (до 40%) [117] может произойти из-за хелатирующих кальций антикоагулянтов, например цитратов, оксалатов, ЭДТК [116], альбумина [104] или других неспецифических компонентов плазмы [106], которые могут препятствовать окислению H₂O₂.

В связи с этим дополнительным химическим методом допускается заменять прямые оптические методы, приведенные в [102], [105] или [118], с сопоставимой чувствительностью и воспроизводимостью. Следует учитывать, что невозможно исключить химически индуцированные изменения гемоглобина и его спектров, которые могут сделать некоторые гемоглобиновые пробы недействительными. Следует сделать поправки, компенсирующие фоновые помехи эндогенной плазмы, так как они также могут изменить спектры гемоглобина [109]. Исследователь должен учитывать эти ограничения определения гемоглобина в плазме и удостовериться, что он использует достоверную методику [104], [109], [115], [170]. Это включает оценку исследуемого супернатанта на наличие преципитата и сравнение его оптических спектров (например, от 400 до 700 нм) со спектрами изолированного оксигемоглобина.

D.5.1.3.2 Иммунонефелометрический метод

Иммунонефелометрический метод основан на определении гемоглобина плазмы посредством нефелометрии с применением коммерчески доступного антитела. Метод пригоден для обычной работы. Существует хорошая корреляция и сопоставимость с оптическими методами [107].

D.5.2 Консервация крови и компонентов крови

В настоящем подразделе приведены сведения о лучших методах сохранения компонентов крови человека, продемонстрированных Американской Ассоциацией Банков Крови [99] и Советом Европы [101]. Материалы и МИ следует исследовать, используя кровь, биохимическое состояние которой имитирует условия, при которых МИ будет функционировать в клинической практике, например надлежащий выбор антикоагулянта, минимальное использование консервантов крови и соответствующий pH крови [151] - [156].

Для применения при заборе крови были разработаны растворы антикоагулянтов, которые предотвращают свертывание крови и обеспечивают сохранность эритроцитов в течение определенного временного интервала. Все эти растворы содержат цитрат натрия, лимонную кислоту и глюкозу; дополнительно некоторые содержат аденин, гуанозин, маннитол, сахарозу, сорбитол и/или фосфат, также см. [151] - [156]. Хотя гепарин не применяют для консервации крови, его часто используют в клинике в качестве антикоагулянта при хирургических вмешательствах.

Свертывание крови предотвращают связыванием цитратом кальция. Эритроциты метаболизируют глюкозу во время хранения. Две молекулы аденозинтрифосфата (АТФ) вырабатываются фосфорилированием аденозиндифосфата (АДФ) на каждую молекулу глюкозы, метаболизированную путем цикла анаэробного гликолиза Эмбдена-Мейергофа-Парнаса. Молекулы АТФ поддерживают энергетические потребности эритроцитов для поддержания упругости мембраны и определенных функций мембранного переноса. При конверсии АТФ в АДФ выделяется энергия, необходимая для поддержания этих функций. Для увеличения времени консервации крови следует снизить щелочность среды добавлением лимонной кислоты к раствору антикоагулянта. Это обеспечивает необходимую высокую концентрацию ионов водорода для консервации эритроцитов при 4 °C. Увеличение кислотности в течение консервации снижает скорость гликолиза. Концентрация аденозиновых нуклеотидов (АТФ, АДФ, АМФ) падает со временем консервации, но добавление аденозина к раствору антикоагулянта позволяет синтезировать замену АМФ, АДФ и АТФ.

При приготовлении концентратов эритроцитов значительная порция глюкозы и аденина удаляется с плазмой. Достаточная жизнеспособность эритроцитов после удаления плазмы может поддерживаться только для не сильно концентрированных суспензий клеток. Нормальные цитрат-фосфат-декстроза (ЦФД)-аденин концентраты эритроцитов не должны иметь объемное содержание эритроцитов более 0,80. Даже если удалено более 90% плазмы, жизнеспособность эритроцитов может поддерживаться введением ряда добавок или суспензионной среды. Хлорид натрия, аденин и глюкоза необходимы для жизнеспособности, в то время как маннитол или сахароза могут быть применены для дальнейшей стабилизации клеточной мембраны и предотвращения гемолиза [99].

Пригодность контейнеров для хранения продуктов крови оценивают различными методами, которые измеряют качество продукта крови [103], [106]. Контейнер с эритроцитарной массой, содержащей соответствующий антикоагулянт, хранят в вертикальном виде при температуре от 1 °C до 6 °C при статических условиях. Через определенные интервалы измеряют количество свободного гемоглобина плазмы для оценки жизнеспособности и качества сохраняемого продукта. Качество сохраняемого продукта может быть улучшено осторожным перемешиванием раз в неделю. Сохранность продукта в контейнере косвенно свидетельствует о проницаемости контейнера для выделяющегося в результате метаболизма эритроцитов двуокиси углерода при отсутствии других мешающих факторов.

D.5.3 Защита персонала при работе с кровью

Должны быть утверждены соответствующие инструкции, регламентирующие работу и защиту персонала, получающего, обрабатывающего и работающего с потенциально зараженной кровью человека. Потенциально зараженные материалы включают кровь и другие физиологические жидкости, продукты, оборудование, бывшее или имеющее контакт с кровью или другими физиологическими жидкостями и материалами, используемыми при культивировании организмов, вызывающих инфекции, переносимые с кровью [114].

D.5.4 Забор крови из вены пациента (флеботомия)

Невозможно гарантировать 100%-ную стерильность поверхности кожи при флеботомии, поэтому необходима стандартизованная процедура подготовки области прокола вены. Следует дать антисептическому раствору высохнуть на поверхности кожи до венопункции и убедиться, что никакого дальнейшего контакта не произошло с поверхностью кожи до введения флеботомической иглы [99].

Система закрытых контейнеров (т.е. не содержащая комнатного воздуха) предпочтительна для забора крови во избежание микробной контаминации. Проколы иглы в резиновой пробке флакона с образцом должны быть полностью закрыты после удаления иглы, иначе частичный вакуум, созданный после охлаждения крови, может втянуть загрязненный воздух [99].

Примечание - Использование вакуумной пробирки может потенциально вызвать легкий гемолиз [125] - [127].

 

Кровь, собранная в открытой системе, может быть загрязнена воздействием комнатного воздуха и не считается стерильной. Микробная контаминация является известной причиной гемолиза.

D.5.5 Выбор вида

Исследование гемолиза следует проводить на эритроцитах человека. Несколько факторов могут затруднить этот выбор или сделать его невозможным. В некоторых странах запасы крови человека ограничены и должны сохраняться для трансфузий человеку. Следует учитывать критерии здоровой донорской крови человека и животных. Кровь имеет ограниченный "срок хранения", и может быть затруднено получить клетки крови человека в заданное время. Для эритроцитов животных следует учитывать разницу в стабильности мембран клеток разных видов, чтобы обеспечить 100%-ный гемолиз при получении общего количества гемоглобина, содержащегося в эритроцитах. Отрицательные контроли должны вызывать минимальный гемолиз, чтобы не маскировать активность тестируемого материала. Выявлено, что эритроциты кролика и человека имеют сходные гемолитические свойства, в то время как эритроциты обезьяны более чувствительны, а эритроциты морской свинки - менее чувствительны к внешним воздействиям [95] - [98], [123].

D.5.6 Оценка степени гемолиза при контакте изделия/материала с кровью или ее компонентами in vitro, ex vivo и in vivo

Величина гемолиза может быть оценена при контакте материалов или изделий с кровью методами in vitro, in vivo и ex vivo. Методы in vitro используют при исследовании материалов и изделий, методы ex vivo и in vivo - для оценки изделий, которые могут содержать более одного материала.

Возможны оценки in vivo и ex vivo в моделях на животных или при клинических исследованиях.

Необходимо обоснование для любого из следующих планов исследования. В первом случае исследуемое изделие сравнивают с коммерчески доступными изделиями с известными допустимыми уровнями гемолиза. Во втором случае объект исследования оценивают на предмет клинически значимых последствий гемолиза.

Целью испытаний in vivo или ex vivo является характеристика гемолитического потенциала МИ. Предварительные тесты in vitro допускается проводить с использованием свежей или просроченной крови человека или животных. Для МИ, предназначенных для применения ex vivo, общей практикой является рециркуляция крови через изделие в условиях, имитирующих клинические, но преднамеренно в более жестких условиях относительно условий его нормального функционирования (например, наивысшая скорость кровотока). Для некоторых МИ далее проводят модельные эксперименты ex vivo на животных или ограниченные контролируемые исследования на человеке. Дизайн этих исследований зависит от размера МИ и его функционального назначения.

D.5.7 Прямой контакт по сравнению с непрямыми методами

Необходимые условия экстракции установлены в ISO 10993-12. Некоторые методы требуют прямого контакта МИ с эритроцитами, в то время как другие описывают приготовление экстракта, который затем вносят в суспензию эритроцитов. Выбор испытания должен быть основан на самом изделии и условиях его применения. Если изделие применяют при повышенных температурах, то следует проводить экстракцию при условиях, установленных ISO 10993-12.