ГОСТ ISO 10993-4-2020. Межгосударственный стандарт. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 4. Исследования изделий, взаимодействующих с кровью

Приложение C

(справочное)

 

ТРОМБОЗ. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ IN VIVO

 

C.1 Общие положения

Для исследования процессов тромбообразования применялись многочисленные подходы. Тем не менее для МИ и материалов, контактирующих с кровью, природа тромбоза in vivo привела к тому, что методы, приведенные в C.2 и C.3, стали более широко применять для оценки тромбоза, связанного с МИ. Эти методы применяют для оценки изделий для постоянного и временного контакта с кровью. В настоящем стандарте показано, что разнообразие областей применения МИ, контактирующих с кровью, диктует необходимость разнообразия моделей in vivo для того, чтобы адекватным образом имитировать условия клинического применения конкретного МИ.

Метод, приведенный в C.2, общепринят как наиболее подходящий подход к оценке изделий на предмет тромбоза, так как при этом методе данное изделие оценивают в его предназначенной имплантируемой конфигурации в модели на животных. Главными элементами в этой работе являются отработка протокола исследований на животных согласно ISO 10993-2 с тщательной имитацией клинического применения МИ и включение в протокол подробных методов и анализов, используемых для оценки степени тромбоза.

Метод, приведенный в C.3, применяют реже, и он не является общепринятым во всем мире. Тем не менее он может требоваться или запрашиваться отдельными регулирующими органами. Метод называют "модель не антикоагулянтной венозной имплантации" (НАВИ), т.е. при имплантации не используют антикоагулянт, и "модель антикоагулянтной венозной имплантации" (АВИ), т.е. имплантация выполняется с использованием антикоагулянта. Сам метод включает введение изделий в форме катетера или материалов изделия, которым придана форма катетера, в вены животных на период до 4 ч с последующей макроскопической оценкой количества тромба на поверхности материала/катетера. Недостатки и преимущества метода представлены в таблицах C.3 и C.4, соответственно. Из-за отмеченных недостатков и во избежание ложного вывода о тромбогенности материалов и изделий интерпретация данных, полученных при использовании этой модели, требует особой осторожности [143], см. также A.3.

Когда тестируемое изделие является изделием катетерного типа, имплантируемым в вену, методы в C.2 и C.3 эквивалентны.

C.2 Имплантационный тест in vivo готового медицинского изделия в доклиническом исследовании на животных

Испытания in vivo на животных проводят на МИ, предназначенных для имплантации при клиническом применении (см. 6.1.6, 6.3.2 и 6.3.3). Протоколы должны включать подробные методы для исследования процессов взаимодействия изделия с кровью, например анализ:

a) самого изделия;

b) образцов крови после испытания МИ;

c) состояние тканей и органов.

Такое доклиническое исследование должно использовать модели in vivo, которые имитируют условия при практическом применении МИ, например место имплантации, геометрию, поток, длительность контакта, температуру, стерильность и т.д. (см. 6.1.2), и включать необходимые контроли, например изделие-аналог (см. 6.1.3). Следует проводить тестирование только на настоящих готовых изделиях или их компонентах (см. 6.1.4), так как исследования на МИ-полуфабрикатах и исследование в плохо имитированных условиях применения не будут с высокой точностью прогнозировать функционирование изделий в клинической практике (см. 6.1.6).

Соответственно МИ, предназначенные для функционирования ex vivo, и МИ для функционирования in vivo должны быть исследованы на адекватных моделях ex vivo и in vivo соответственно. Антикоагулянты в моделях ex vivo и in vivo должны совпадать с типом и количеством антикоагулянтов, используемых при клиническом применении изделия, и соответствовать ИП к МИ (см. 6.1.12). Выполнение достаточного количества повторов исследования, методы статистического анализа и его результаты должны быть использованы в исследованиях на животных (см. 6.1.14 и [213] - [216]).

Исследования следует проводить, если возможно, в следующих категориях тестов: тромбоз, свертывание крови, тромбоциты, гематология и активация комплемента, как описано в таблице 2. Как пример, один тест может состоять из макроскопического исследования и РЭМ анализа изделия для оценки степени тромбоза, связанного с изделием. Осмотр состояния органов ниже по кровотоку (например, легкое и почка) для установления признаков тромбоэмболий поможет при оценке вероятности тромбоэмболии, связанной с МИ. Если присутствуют соответствующие антитела, то процесс свертывания крови может быть оценен измерением в плазме крови концентраций индикаторов коагуляции и формирования фибрина, например ТАК и ФПА, измеряемых методом ИФА. Также простой подсчет тромбоцитов и/или измерение маркеров активации тромбоцитов, например , могут быть использованы для оценки влияния МИ на тромбоциты. Обычный дифференциальный подсчет клеток крови и свободного гемоглобина в плазме допускается применять для общей оценки факторов гематологии и оценки механического повреждения клеток крови. Для МИ с большой площадью поверхности, с учетом наличия антител, количества в плазме различных факторов комплемента, может быть использован для оценки активации комплемента по альтернативному пути.

Желательно, чтобы исследуемое МИ не влияло слабо или оказывало одинаковое влияние на измеряемый параметр по сравнению с результатами, наблюдаемыми на МИ-аналоге. Более высокие результаты, чем на МИ-аналоге, могут быть обоснованы с помощью анализа риска/преимущества. При исследовании МИ без аналогов должны быть выбраны и обоснованы соответствующие контроли. Такие оценки предпочтительны с использованием метода, приведенного в C.3, так как этот метод наиболее полно имитирует применение in vivo. Следует свериться с "вертикальными" стандартами в различных областях МИ. Для последних допускается применять стандарты, указанные в библиографии.

Примечание 1 - Для МИ в форме катетера, предназначенных для имплантации в венозную систему кровообращения, модели имплантации с антикоагулянтами или без, см. C.3, являются адекватным подходом к исследованию in vivo этих МИ.

Примечание 2 - Для МИ в форме катетера, предназначенных для имплантации в артериальную систему кровообращения, модели имплантации с антикоагулянтом (АВИ) или без (НАВИ), см. C.3, являются адекватным подходом к исследованию in vivo этих МИ.

 

См. также 6.3.3 и приложения A и B.

C.3 In vivo НАВИ и АВИ исследования на тромбогенность

Сущность исследований НАВИ и АВИ заключается во введении изделия в форме катетера (или другой подходящей формы) или материала МИ, которому придана форма катетера, в вену крупного животного. Данный вид теста необходим в случаях, например, когда требуется оценка тромбогенности новых катетеров, покрытия, материала или при изменении поставщика или технологического этапа обработки материала/МИ. В самой модели используют несколько венозных позиций (см. рисунки C.1 и C.2). При отсутствии (НАВИ) или в присутствии (АВИ) антикоагулянтов допустима имплантация двух или трех имплантатов для инкубации in situ на период до 4 ч (случаи меньшего и большего времени инкубации должны быть обоснованы, учитывая конкретное применение изделия). Затем имплантаты удаляют и оценивают на предмет количества видимых тромбов на поверхности образцов. Наиболее часто используют модель бедренной или яремной вены собаки. Тестируемый материал/МИ размещают в одной из вен, а контрольный материал или аналоговое МИ помещают на контралатеральной (расположенной на противоположной стороне тела) вене. Исследование требует от двух до трех крупных животных, с чередующимися местами имплантации объекта тестирования и контроля во избежание предвзятости и оценки тромба на изделиях, используя метод подсчета, такой как приведен в таблицах C.1 и C.2. Результаты могут быть дополнены гравиметрическим анализом обнаруженного тромба и исследованием проходимости сосудов. Тромбогенность тестируемого изделия должна быть эквивалентна или быть меньше по сравнению с соответствующими, при их наличии, промышленными аналогами, или должны быть обоснованы другие критерии оценки. Следует удостовериться, что исследованы все контактирующие с кровью при клиническом применении компоненты изделия. Различные мировые регулирующие органы рекомендуют, чтобы было имплантировано до 15 см объекта тестирования и контроля для обеспечения адекватного воздействия в течение исследования. В зависимости от конфигурации МИ может потребоваться создание специального изделия для сокращения длины компонентов при сохранении того же соотношения материалов, что и в готовом изделии. В качестве альтернативы если необходимо, то МИ может быть поделено на несколько исследуемых образцов.

 

 

1 - бедренная вена; 2 - яремная вена

 

Рисунок C.1 - Основные позиции при имплантации

изделий, используемые в моделях НАВИ/АВИ

 

 

 

 

1 - НПВ-НПВ (где НПВ - нижняя полая вена); 2 - ВПВ-НПВ

(где ВПВ - верхняя полая вена); 3 - НПВ-АА

(где АА - абдоминальная аорта)

 

Рисунок C.2 - Другие, менее часто используемые позиции

при имплантации изделий, в моделях НАВИ/АВИ

 

ВНИМАНИЕ - Имплантация в указанные позиции требует внимательного рассмотрения артефактов, обусловленных возможным взаимодействием имплантированных изделий и/или неопределенности места формирования тромба.

 

Таблица C.1

 

Схема A подсчета НАВИ/АВИ

 

Описание оценки формирования тромба	Оценка
Отсутствие значительного тромбоза (очень маленький сгусток приемлем при введении)	0
Минимальный тромбоз, одно местоположение	1
Минимальный тромбоз, множественные местоположения	2
Значительный тромбоз, от 1/4 до 1/2 включительно поверхности имплантата, сосуд проходим	3
Значительный тромбоз, более 1/2 поверхности имплантата, сосуд проходим	4
Просвет сосуда полностью закрыт	5

 

Таблица C.2

 

Схема B подсчета НАВИ/АВИ

 

Описание оценки формирования тромба	Оценка
Тромб отсутствует или минимален и, при наличии, может быть связан с местом венотомии имплантата	0
Тромб минимальный, при наблюдении покрывает от 1% до 25% поверхности материала	1
Тромб умеренный, при наблюдении покрывает от 26% до 50% поверхности материала	2
Тромб серьезный, при наблюдении покрывает от 51% до 75% поверхности материала	3
Тромб обширный, при наблюдении покрывает от 76% до 100% поверхности материала	4

 

Для МИ и материалов, предназначенных для имплантации в артерии, методы тестирования должны быть соответственно изменены на имплантацию объектов тестирования в артериальную позицию.

ВНИМАНИЕ - Вариативность в результатах наблюдалась между:

a) исследовательскими центрами;

b) сотрудниками, проводящими исследования;

c) повторными исследованиями на том же материале;

d) показателями, полученными от контролей [143].

В таблице C.3 обобщены основные недостатки моделей НАВИ и АВИ. В таблице C.4 представлены некоторые отмеченные преимущества моделей НАВИ и АВИ. Величайшей ценностью модели может быть тестирование материалов, преднамеренно измененных для сокращения времени острого формирования тромба, например при оценке гепариновых покрытий.

 

Таблица C.3

 

Недостатки ("подводные камни") при использовании

моделей НАВИ или АВИ

 

Фактор	Описание	Предостережения
1	Позиция имплантата	Условия высокого потока ведут к низким уровням тромбообразования, связанного с поверхностью, и наоборот. Следовательно, небольшие различия в анатомических факторах, таких как намеченные диаметры сосудов и/или позиции венозных клапанов, могут иметь потенциальное влияние на количество наблюдаемого тромба. Дополнительно, если имплантат помещен под углом или в позиции, которая изменяет кровоток, создавая вихревые движения, ведущие к стазу крови, формирование тромба может произойти безотносительно свойств материала исследуемого изделия
2	Методика имплантации	Каждый объект исследования и контроль должны быть идентичны и точно введены в вены-мишени при расположении каждого в идентичной позиции (предпочтительно центральное расположение с отсутствием контакта со стенкой сосуда)
3	Степень контакта изделия со стенкой сосуда	Данный фактор относится к повреждению стенки сосуда/эндотелиальной денудации в течение периодов имплантации и инкубации. Сам имплантат может способствовать тромбозу в результате механического контакта со стенкой сосуда, который индуцирует повреждение и активацию тканевого фактора. В данном случае фактор материала может играть второстепенную роль в степени наблюдаемого тромба, а геометрия МИ может играть главную роль
4	Время/период инкубации	Главный измеряемый параметр протяженности поверхностно ассоциированного тромба имеет тенденцию быть интенсивным в течение первых 1/2 ч до 2 ч. Через некоторое время после этого периода тромболитическая (фибринолитическая) система может инициировать и удалить биохимически некоторые из сопутствующих тромбов
5	Методика эксплантирования	В зависимости от состава и протяженности поверхностно ассоциированного тромба на образце измеряемый/подсчитываемый материал тромба может быть хрупким и быстро отшелушиваемым в течение забора МИ/экспозиции. Без особой предосторожности этот материал, часто называемый "рукавным тромбом", может "отскребаться", если образец забран или задет в месте имплантации. Некоторые исследователи используют фиксацию перфузии in situ, чтобы смыть неприлегающие элементы крови и одновременно перекрестно связать МИ/тромб/сосуд в более сильную (и более физиологическую) геометрию
6	Материал/поверхность материала	Данная модель применялась для оценки тромбогенного потенциала новых материалов, оценки изменений процесса на существующих зарегистрированных материалах и для квалификации новых поставщиков. Часто легально продающееся изделие сравнения (LMCD) или материал используются в качестве контроля, который предоставляет равно вариативные результаты
7	Нетромбоадгезивные материалы	Работа специалистов в данной области [177] - [179] продемонстрировала, что гидрофильные поверхности могут быть тромбогенными (и тромбоэмболическими), но не тромбоадгезивными. Этот тест дает проходные баллы МИ и материалам, которые являются тромбогенными и тромбоадгезивными
8	Тромботический потенциал реципиента/испытуемого	Результаты работы в данной области [56], [57], [180] выявили, что реципиенты (лабораторные животные) могут иметь существенно разные "тромботические потенциалы", т.е. различную способность к формированию тромба при воздействии медицинских имплантатов и других факторов. Это может привести к значительным отличиям в подсчетах тромботического потенциала между разными испытуемыми
9	Статистическая достоверность	В соответствии с ISO 10993-2 в сочетании с вариативностью ответов, наблюдаемых между изделиями и материалами-аналогами и между объектами исследования (лабораторными животными), получение статистически значимого заключения часто является невозможным
10	Опыт испытателя	Подготовка и навыки испытателя, оценивающего по балльной системе процесс формирования тромба, являются чрезвычайно важными. Некоторые могут затрудняться в отличии настоящего тромба in vivo от ложного тромба [по/досмертных (агональных) формирований сгустков]
11	Влияние антикоагулянтной схемы	Почти все МИ и материалы, исследуемые в модели АВИ, получают нулевой балл и проходят испытание. Это ставит под вопрос цель и обоснование использования модели АВИ. В модели НАВИ большинство гидрофобных материалов демонстрируют различные степени тромбообразования, а гидрофильные материалы демонстрируют незначительные уровни тромбоза
12	Размер имплантата к диаметру сосуда	Кроме потенциального повреждения стенки сосуда, если размер имплантата слишком велик относительно диаметра сосуда, он может повлиять на кровоток (стагнация), предрасполагая к тромбозу. Поперечная область имплантата должна занимать не более 50% просвета сосуда

 

Таблица C.4

 

Преимущества использования моделей НАВИ или АВИ

 

Фактор	Описание	Предостережения
1	Изучение формирования тромба	Модель НАВИ, как известно, последовательно демонстрирует значительное формирование тромбов in vivo на гидрофобных полимерах, особенно после 1 ч или менее воздействия. В таком виде модель НАВИ подходит для исследования формирования тромба. Например, она может быть полезным инструментом для исследования влияния тромба на функциональные свойства изделий, такие как внутрисосудистые сенсоры [143]
2	Оценка покрытий, предназначенных для снижения тромбогенности	Покрытия, нанесенные на поверхности изделия для снижения его тромбогенности, должны продемонстрировать измеряемые различные и последовательные ответы, т.е. ниже, чем неизмененные контроли, при тестировании на модели НАВИ. Внимание - Испытание должно включать этапы оценки тромбоэмболического потенциала, так как нетромбоадгезивные поверхности могут быть тромбогенными
3	Оценка покрытий, предназначенных для увеличения тромбогенности	Покрытия, нанесенные на поверхности МИ для увеличения тромбогенности, должны продемонстрировать измеряемые различные и последовательные ответы, т.е. выше, чем немодифицированные контроли, при исследовании на модели НАВИ или АВИ. Внимание - Испытание должно включать этапы оценки тромбоэмболического потенциала, так как тромбогенные поверхности могут продуцировать эмболы
4	Скрининг материалов для сердечно-сосудистого применения	Модели НАВИ и АВИ являются наиболее подходящими для испытаний МИ катетерного типа, предназначенных для введения в сосудистую систему на короткие периоды времени. Множество материалов и конструкций изделий допускается исследовать в этой модели с использованием контралатерального кровеносного сосуда для оценки контроля или немодифицированной версии исследуемых изделий