ГОСТ ISO 10993-4-2020. Межгосударственный стандарт. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 4. Исследования изделий, взаимодействующих с кровью

Приложение B

(справочное)

 

РЕКОМЕНДУЕМЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

 

B.1 Основные положения

B.1.1 Основание

Общие положения и научные основы наиболее часто используемых тестов для категорий гемолиза, тромбоза, системы свертывания крови, тромбоцитов, гематологии и системы комплемента (см. 6.2) приведены в B.1 - B.3. См. приложения C, D и E для дальнейшей информации по методам тестирования для категорий биологического ответа крови на контакт с чужеродной поверхностью (тромбоз, гемолиз и система комплемента).

Дополнительные и менее распространенные методы могут быть полезны для дальнейшей оценки конкретных стадий взаимодействий МИ с кровью (см. приложение F). Из-за биологического разнообразия и технических ограничений точность и информативность многих из этих методов требуют тщательного внимания к методологии и осторожности в интерпретации результатов. В приложении G приведен перечень нерекомендуемых тестов.

В B.4 представлено описание методологии для исследований факторов плазмы крови, специфичных для системы свертывания крови, активации тромбоцитов и лейкоцитов, активации системы комплемента, используя метод твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) или другие аналогичные методы.

Подробное описание с примерами исследований (испытаний) и моделей приведено в стандартах, указанных в библиографии.

B.1.2 Исследования in vitro в сравнении с исследованиями ex vivo и in vivo

B.1.2.1 Целый ряд моделей in vitro, ex vivo и in vivo интенсивно используют для исследования гемосовместимости материалов/изделий [1] - [30], [42] - [147], [157] - [237]. Следует выбирать модель, наиболее подходящую к назначению МИ и цели исследования, а также в соответствии с ISO 10993-12 относительно надлежащего приготовления образцов и контролей.

Не существует единой модели in vitro, ex vivo или in vivo, подходящей для МИ различного назначения. Следовательно, должна быть обоснована адекватность модели относительно исследуемого объекта.

Тесты in vivo представляют более реалистичную имитацию условий конечного применения МИ, но осложнены следующими факторами:

- выбор подходящего лабораторного животного;

- межвидовая и индивидуальная вариативность в ответах [47], [71], [148] - [150];

- малочисленность видоспецифичных коммерческих тест-наборов для общепринятых индикаторов тромбоза и системы свертывания крови [58] - [60];

- повышенные затраты, этические и статистические вопросы, связанные с использованием лабораторных животных.

B.1.2.2 Следует сверить с "вертикальными" стандартами для предпочтительных моделей [1] - [41]. См. [186] для молодых овец в качестве ускоренной модели для исследования кальцификации биопротеза клапана, см. [187] для взрослых свиней или овец для исследования клапанов, размещенных вне сердечно-сосудистой системы и in situ имплантированных клапанов, см. [217] - [231] для моделей замены бедренной вены на взрослых собаках и овцах, используемых при испытаниях образцов протезов кровеносного сосуда малого и большого диаметра, см. [232] - [235] для модели коронарных сосудов на свиньях, широко используемой для исследований конструкций коронарных стентов.

B.1.2.3 Как описано в других частях ISO 10993, тщательно проведенные исследования in vitro предлагают валидированные скрининговые инструменты для оценки биологической безопасности МИ и материалов.

Важными факторами в модели in vitro, которые требуют конкретизации, являются:

- объем цельной крови в выбранной тест-системе (например, трубка, петля или другая модель);

- время контакта с кровью;

- температура крови;

- состояние кровотока;

- тип и концентрация антикоагулянта;

- значение удельной площади контакта с кровью, т.е., отношение площади поверхности материала/изделия (см²) к объему цельной крови в системе (мл);

- площадь поверхности самой тест-системы, контактирующей с кровью (см²).

Примечание 1 - "Фаза контакта с кровью" исследования in vitro требует четкого определения условий контакта тестируемого материала/МИ с кровью. Чем лучше условия исследования имитируют клиническое применение материала/МИ, тем выше становится адекватность модели и оцениваемого параметра.

Примечание 2 - В следующей за фазой контакта "Фазе испытания" исследуют конкретные характеристики крови, плазмы крови или самого материала/МИ. Исследование в "Фазе испытания" обычно направлено на одну или более из общих категорий, т.е. гемолиз, тромбоз, система свертывания крови, тромбоциты, гематология и система комплемента.

 

В B.2 и B.3 приведены общепринятые методы, используемые для оценки основных категорий биологического ответа крови при контакте с поверхностью МИ (см. таблицу 2).

B.2 Тромбоз

B.2.1 Макроскопический анализ. Забор и оценка, аутопсия дистальных органов

Макроскопический анализ всегда должен быть включен в основную оценку изделия, так как данный вид исследования изделия имеет особую важность при оценке биологических ответов крови in vivo на имплантированные МИ. Данный метод позволяет тщательно и подробно определить распределение, видимый размер и характер клеточных и белковоподобных депозитов, а также выявить наличие любой природы эмболий [7], [205] - [207].

Проявление некропсии дистальных органов является обоснованием необходимости исследования периферийных эффектов (таких, как эмболии), имплантированных МИ. Важность этого анализа зависит от применения изделия, и он используется для изделий со средней или высокой степенью риска тромбоэмболии или эмболизации материала/изделия, например таких, как механические клапаны сердца и интрааортальные баллон-насосы [206].

В этом типе исследований как ключевые моменты выделяются и соответственно маркируются изображения (изделия и прилегающих тканей и т.д.) на цветной пленке или цифровые камеры с небольшим и/или большим увеличением с высоким разрешением.

B.2.2 Степень окклюзии, свободная и покрытая тромбом площадь поверхности

Степень окклюзии сосудов может быть количественно оценена в процентах методами визуализации во время прижизненного этапа исследования с помощью контрастной рентгенографии и ультразвукового исследования. Степень окклюзии также может быть проанализирована визуально после удаления имплантированного изделия. Процент окклюзии может служить количественным критерием интенсивности тромботического процесса на внутренней поверхности изделия. Тем не менее отсутствие окклюзии не исключает наличие тромботического процесса, так как тромбы могли оторваться, образуя эмболы, или сместиться до измерения степени окклюзии. Окклюзия может быть вызвана не только тромбозом, но и гиперплазией интимы, особенно в перианастомотических местах в сосудистых протезах. Таким образом, вспомогательное микроскопическое исследование полезно для определения характера окклюзивного процесса. Определения площади поверхности, покрытой тромбами и свободной от них, являются полуколичественными или количественными методами, которые могут быть использованы на сравнительной основе с исследуемыми и/или контрольными МИ.

B.2.3 Оптическая микроскопия

Этот полуколичественный метод позволяет получить информацию о плотности распределения адгезированных на поверхности клеток, наличии клеточных агрегатов, составе инкапсулирующей ткани, интенсивности ответа на инородное тело, присутствии тромба или фибрина на поверхности материалов. Также возможна оценка пространственного распределения этих отложений на материалах или МИ.

Для полимерных или биологических материалов и изделий могут быть использованы метод заливки в парафине и специальные красители для гистологической оценки поверхности МИ.

Для металлических и керамических материалов и изделий полезны более современные методики заливки тугим пластиком и приготовления срезов для сохранения неповрежденной поверхности материала/изделия после ее контакта с кровью и тканями [207] - [211].

B.2.4 Растровая электронная микроскопия (РЭМ)

Обоснование и интерпретация метода РЭМ аналогичны оптической микроскопии (см. B.2.3). Метод РЭМ имеет преимущество перед методами оптической микроскопии, так как дает более подробную информацию о тонкой структуре изучаемых объектов. Количественный анализ требует достаточного количества повторных измерений для установления степени воспроизводимости результатов. Метод РЭМ лучше всего подходит для визуализации состояния поверхности. РЭМ также допускается использовать для анализа срезов, если дополнительные подробности относительно структурных особенностей взаимодействий клеток и тромба являются информативными [70], [71], [143], [205], [206]. Морфологическая оценка активации тромбоцитов и лейкоцитов, фибрина и формирования тромба при контакте изделия с циркулирующей кровью или ее компонентами (например, плазмой, обогащенной тромбоцитами) по сравнению с контролями может также дать ценную информацию [143], [173].

B.3 Гемосовместимость in vitro

B.3.1 Гемолиз. Методы исследования

Гемолиз считают основным экспресс-тестом, потому что повышенный уровень гемоглобина плазмы in vivo является абнормальным и может указывать на лежащую в основе гемопатологию или сосудистую проблему. При корректном проведении исследования повышенный уровень гемоглобина плазмы указывает на гемолиз, т.е. на процесс высвобождения содержания эритроцитов (RBC), что может быть связано с хрупкостью мембраны эритроцитов или повреждением эритроцитов. При оценке процесса взаимодействия материала/изделия с кровью гемолиз может произойти по следующим причинам:

a) прямой контакт крови с поверхностью/поверхностями материала/изделия (гемолиз, индуцированный материалом);

b) непрямой контакт крови с химическими веществами, экстрагируемыми из материала/изделия (гемолиз, индуцированный материалом);

c) воздействие турбулентности и повышенные (т.е. не физиологические) значения сдвиговых напряжений при тестировании изделия (гемолиз, индуцированный механическим воздействием).

См. приложение D для более подробных деталей по исследованию гемолиза.

B.3.2 Активация системы свертывания крови. Методы исследований

B.3.2.1 Общие положения

Каскадный механизм свертывания крови имеет два параллельных пути, путь контактной активации (внутренний путь) и путь тканевого фактора (внешний путь), которые сливаются для формирования общего пути. Последний включает белок тромбин, который катализирует формирование фибрина, главного компонента тромба. Выявлено, что основным путем для начала свертывания крови является путь тканевого фактора; свертывание крови, связанное с МИ/материалами, контактирующими с кровью, происходит путем контактной активации. Сами пути являются серией каскадных реакций активации, при которых неактивные проферменты (называемые зимогенами) последовательно взаимодействуют с их гликопротеиновыми кофакторами для превращения в активные компоненты. Реакции заканчиваются образованием активного тромбина, который затем катализирует формирование фибрина. Факторы свертывания, как правило, обозначают римскими цифрами с добавлением строчной буквы "a" для их активной формы (см. рисунок B.1).

 

 

Рисунок B.1 - Каскадный механизм активации

свертывающей системы крови

 

Оценку коагуляционной активности, т.е. степени изменения концентрации белков в крови, участвующих в формировании тромбина и фибрина (см. рисунок B.1), всегда выполняют методами лабораторно-клинического анализа, измеряющими концентрации ключевых белков в плазме, участвующих в каскадном процессе свертывания крови. Концентрации таких белков системы свертывания крови в норме (состояние гомеостаза) известны так же, как и некоторые повышенные их концентрации, наблюдаемые в клинике при различных коагулопатиях. Основанием использования этих методов для исследования гемосовместимости МИ является то, что биологически безопасные материалы и изделия не должны проявлять чрезмерную коагуляционную активность, которая может подвергнуть пациента риску тромбоза и тромбоэмболий. Высокие уровни коагуляционной активности могут быть индикатором повышенной способности материала/изделия индуцировать прямо или опосредованно острый тромбоз или тромбоэмболии. Для измерения коагуляционной активности клинико-диагностические лаборатории часто используют методы ИФА. В основном исследовании, зависящем от наличия соответствующих антител к видоспецифичным эпитопам-мишеням белков свертывания крови, которое может быть проведено in vivo или in vitro, образцы крови забирают при определенных условиях с последующей пробоподготовкой и анализом согласно ИП тест-набора. Типичные определенные условия или факторы, важные в модели in vitro, приведены в B.1.2.3. Сравнение результатов с надлежащими контролями, такими как отрицательные контроли (например, базовые уровни или отсутствие воздействия материала/изделия на кровь) и результаты для зарегистрированного аналога тестируемого изделия/материала, является обязательным. Статистически достоверная более высокая активация свертывающей системы крови исследуемым материалом/МИ по сравнению с контролями может быть индикатором того, что применение материала/изделия имеет высокий риск осложнений, связанных со свертыванием крови. Примеры белков активации свертывающей системы крови, для которых существуют коммерчески доступные тест-наборы ИФА, включают ТАК (комплексы тромбин-антитромбин), F.1.2 (фрагмент белка, высвобождаемый из протромбина при формировании тромбина) и ФПА (фрагмент белка, высвобождаемый из фибриногена при формировании фибрина).

Белки, указывающие на активацию свертывающей системы крови, как правило, регистрируют в фазах инициации, распространения и завершения коагуляции [56], [57]. Это отражает начальную реакцию или реакции формирования, период каскада/усиления обратной связи и период замедления/деактивации, когда критичные прекурсоры могут быть использованы или измеренный белок деактивирован белками обратной связи отрицательного контроля. Различия в концентрациях белков активации свертывающей системы крови с течением времени могут достигать порядка величин. Следовательно, необходимо учитывать важный фактор того, когда фаза активации в действительности происходит во время контакта материала/МИ с кровью. Например, степень воздействия исследуемых материалов при перемешивании с кровью может быть совершенно разной для каждой фазы свертывания. Кроме того, так как степень активации белка свертывающей системы крови, как правило, пропорциональна площади поверхности (ПП), контактирующей с кровью, ПП материала/МИ может значительно повлиять на результаты. По этой причине важно обозначить исследуемое соотношение ПП к объему крови (значение экспозиционной дозы) в каждом исследовании. При возможности значение экспозиционной дозы может рассматриваться как переменная для понимания специфичности действия материала на кровь. Значение экспозиционной дозы от 3,0 см² до 6,0 см²/мл крови (исходя из толщины изделия) соответствует значениям, установленным в ISO 10993-12. Другие значения экспозиционной дозы, которые в 1,5 и 2,0 раза больше, допускается также использовать, так как чем больше площадь поверхности, тем теоретически выше чувствительность системы свертывания на тестируемый материал.

Существует физическое ограничение на количество тестируемого материала, которое может быть исследовано, из-за объема тест-системы, например пробирки, и заданного значения экспозиционной дозы. В таком случае использование гистологических срезов материалов изделия может быть более результативным. Если изделие содержит более одного материала, то следует соблюдать пропорцию в каждом срезе готового изделия. Следует соблюдать осторожность и избегать использования срезов, которые могут привести к появлению существенного количества поверхностей, не контактирующих с кровью.

Существует ряд механизмов, которые возникли в процессе эволюции для контроля каскада свертывания крови. Одним из этих механизмов является белок антитромбин. Антитромбин является ингибитором сериновой протеазы, который может связывать и деактивировать сериновые протеазы тромбина, активированные факторы свертывания крови IXa, Xa, XIa и XIIa. При активном состоянии антитромбин при взаимодействии с гепарином изменяет свою конформацию, что значительно увеличивает его скорость ингибирования протеаз.

Примечание - Исследование методом ИФА факторов свертывания крови представляет собой "фазу испытания" (см. B.1.2), т.е. испытывают образцы крови, полученные после контакта крови с МИ или материалом in vitro или in vivo.

 

Многие стандартные анализы на свертывание крови предназначены для обнаружения клинических нарушений в системе свертывания, которые приводят к замедленному свертыванию или чрезмерному кровотечению, скорее, отклонениям, которые ускоряют свертывание крови/тромбоз. Протоколы для оценки взаимодействия МИ с кровью необходимо соответствующим образом модифицировать, чтобы измерить уменьшение времени свертывания крови после инкубации крови с материалом/МИ.

Существует взаимосвязь между системами свертывания крови и комплемента [143] - [147].

B.3.2.2 Тест-наборы ИФА на тромбин-антитромбин (ТАК), F1.2 и фибрин (ФПА)

Тест-наборы ИФА, непосредственно регистрирующие процессы формирования тромбина (ТАК, F1.2) и фибрина (ФПА), коммерчески доступны. Результатом является количественная оценка имеющихся в пробе тромбина и образующего фибрина, которые отражают уровень происходящей коагуляционной активности и могут быть проявлением возникающего тромбоза. См. B.4 для получения подробной информации о методе ИФА.

B.3.2.3 Частичное тромбопластиновое время (ЧТВ)

ЧТВ - это время свертывания рекальцифицированной цитратной плазмы при добавлении частичного тромбопластина, который не содержит активатор. Частичный тромбопластин является суспензией фосфолипидов, который, как правило, экстрагируют из тканевого тромбопластина, гомогената из мозга или легкого млекопитающих. Сокращение ЧТВ после контакта с материалом при стандартных условиях указывает на активацию внутреннего пути коагуляции крови. Гепарин и другие антикоагулянты вызывают продление ЧТВ [23].

Реагенты для измерения активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) включают активатор, такой как каолин, целит или эллаговая кислота. Реагентов с такими активаторами необходимо избегать при оценке биологического действия МИ, контактирующих с кровью или материалами МИ, потому что они маскируют свертывание крови, вызванное материалами или МИ.

При исследовании процесса коагуляции при контакте крови с медицинскими материалами/изделиями само МИ или материал служат активатором свертывания крови. Соответствующие материалы положительного и отрицательного контроля следует применять при их наличии. Должен быть включен отрицательный контроль, непосредственно плазма крови без инкубации с материалом/МИ.

B.3.3 Тромбоциты. Методы исследования

B.3.3.1 Общие положения

Оценка состояния тромбоцитов и процессов их активации подробно описаны в научной литературе, например, см. [69] - [94]. Тем не менее для МИ и материалов, контактирующих с кровью, наиболее используемыми методами являются простой подсчет тромбоцитов и измерение белков, высвобождаемых при дегрануляции тромбоцитов (тромбоцитарные белки дегрануляции) после инкубации МИ или материалов с кровью в контролируемых условиях. Нормальные уровни тромбоцитов и тромбоцитарных белков дегрануляции в состоянии покоя (гомеостаз) установлены (см. информацию о продукте коммерческого тест-набора ИФА), как и отдельные абнормальные уровни, наблюдаемые при различных клинических тромбоцитопатиях. Основанием проведения такого тестирования МИ является то, что соответствующие материалы и конструкции МИ не должны обладать способностью адгезировать и/или активировать большое количество тромбоцитов, что может подвергнуть пациента риску. Существенное снижение количества тромбоцитов и/или их дегрануляция могут быть индикатором тенденции материала/МИ индуцировать или способствовать этим процессам, которые могут привести к осложнениям в виде кровотечения или тромбоза. Для измерения количества тромбоцитов используют обычный дифференциальный счетчик клеток, степень активации/дегрануляции тромбоцитов оценивают измерением концентрации хорошо определяемых белков из альфа-гранул тромбоцитов методом ИФА. Клинические лаборатории, как правило, используют тест-наборы для измерения концентрации белков из альфа-гранул методом ИФА. В основном данный тест, который может быть проведен in vivo либо in vitro, будет зависеть от наличия соответствующих антител к видоспецифичным эпитопам-мишеням белка гранул тромбоцитов. Образцы крови забирают при определенных условиях, пробы подготавливают и анализируют согласно инструкциям изготовителя. Стандартные конкретные условия или факторы, важные для модели in vitro, приведены в B.1.2.3. Сравнение результатов с соответствующими контролями, такими как отрицательные контроли (например, базовые уровни или тест-система без воздействия материала/изделия), и результатов испытания изделия/материала - аналога, является обязательным. Снижение количества тромбоцитов и повышение концентрации тромбоцитарных белков дегрануляции, которые статистически и биологически достоверно отличаются от контролей, могут быть индикатором того, что тестируемый материал/изделие при контакте с кровью может с большой вероятностью индуцировать процессы адгезии и активации тромбоцитов. В перечень белков из альфа-гранул тромбоцитов, для которых существуют коммерчески доступные тест-наборы ИФА, входят:

- ТФ-4 (тромбоцитарный фактор 4), белок из 70 аминокислот с высокой аффинностью к связыванию с гепарином. Главной физиологической ролью ТФ-4 является нейтрализация гепариноподобных молекул на эндотелиальной поверхности кровеносных сосудов, что приводит к ингибированию локальной активности антитромбина III и способствует свертыванию крови;

- (бета-тромбоглобулин, хемокин для фибробластов и нейтрофилов).

Примечание - Тромбин - компонент каскада свертывания крови, являющийся мощным агонистом тромбоцитов и который может немедленно вызвать дегрануляцию тромбоцитов. Высокие уровни тромбина будут коррелировать с высокими уровнями дегрануляции тромбоцитов.

 

Как и при свертывании крови, на убыль тромбоцитов влияет площадь поверхности, контактирующая с кровью. Таким образом, площадь поверхности (ПП) МИ/материала влияет на результат подсчета количества тромбоцитов в объеме крови. По этой причине следует конкретизировать отношение ПП к объему крови (значение экспозиционной дозы) в каждом исследовании. Значение экспозиционной дозы допускается рассматривать как переменную для понимания специфичности эффекта материала. Значения экспозиционной дозы от 3,0 см² до 6,0 см²/мл крови (основываясь на толщине МИ) соответствуют значениям, установленным в ISO 10993-12. Другие значения экспозиционной дозы, как превосходящие данное отношение в 1,5 и 2,0 раза, допускается использовать, так как более большие площади поверхности теоретически увеличат чувствительность реакции тромбоцитов на тестируемый материал.

Активация тромбоцитов - это процесс, который происходит в течение времени (от минут до часов) и признан потенциально обратимым до определенной точки. После ее прохождения он может необратимо прогрессировать вплоть до значительного изменения формы клеток, потери цитоплазматических составляющих, отшелушивания микрочастиц и полного разрушения. Процесс зависит от типа и количества стимулирующих агентов. Существует множество известных мощных стимуляторов, называемых агонистами тромбоцитов, примерами которых являются тромбин, АДФ и коллаген. Сами чужеродные поверхности, такие как МИ, контактирующие с кровью, также могут вести себя как агонисты, так как они могут индуцировать выработку тромбина. Дополнительно тромбоциты могут прикрепляться к этим поверхностям, оставаться в адгезированном состоянии или открепляться от поверхности в активированном или неактивированном состоянии и пройти через изменения формы, ведущие к разрушению тромбоцитов. Таким образом, оценка степени активации тромбоцитов при заданном времени контакта изделия/материала с кровью будет более достоверной при использовании агентов, позволяющих "задержать" тромбоциты в их физическом и биохимическом состоянии в конкретной временной точке. Следовательно, если оценка состояния тромбоцитов не может быть проведена немедленно после удаления исследуемого материала или изделия из тест-системы, то применяют ряд веществ для предотвращения дальнейшей активации тромбоцитов и стабилизации состояния тромбоцитов [88] - [91]. Примерами этих агентов являются кислый цитрат декстрозы (ACD), цитрат, теофиллин, аденозин, дипиридамол (CTAD) и другие стабилизирующие тромбоциты реагенты, такие как ThromboFix^TM <1>. Применение таких стабилизаторов возможно, если доказано, что не существует их негативного влияния при заданном времени исследования, такого как, например, артефактное воздействие на активацию тромбоцитов.

--------------------------------

<1> ThromboFix^TM является примером коммерчески доступного подходящего продукта. Эта информация приводится для удобства пользователей данного документа и не является поддержкой ISO названного продукта.

 

B.3.3.2 Количество тромбоцитов

Из-за ключевой роли тромбоцитов в предотвращении кровотечения и в общем процессе тромбоза следует определить количество тромбоцитов [45], [121]. Значительное снижение числа тромбоцитов в крови, контактирующей с изделием, может быть вызвано адгезией тромбоцитов, агрегацией тромбоцитов, секвестрацией тромбоцитов (например, в селезенке) или формированием тромба на материалах или изделиях. Уменьшение количества тромбоцитов после имплантации МИ также может быть вызвано ускоренным разрушением или удалением тромбоцитов из кровообращения. Для подсчета тромбоцитов в цельной крови могут быть использованы различные антикоагулянты [151] - [156].

Методики забора крови должны быть воспроизводимыми. Тромбоциты могут стать гиперактивными/активированными при разнообразных условиях, включая неправильный забор крови. Методы агрегометрия тромбоцитов и проточная цитометрия применяют для подтверждения нормальной реактивности и активации тромбоцитов.

B.3.3.3 Активация тромбоцитов: высвобождение гранулярных тромбоцитарных белков: , ТФ-4, TxB2 и морфологические изменения тромбоцитов

Применение ряда материалов или МИ может вызвать активацию тромбоцитов, которая может привести к следующему:

a) высвобождение веществ гранул тромбоцитов, таких как , ТФ-4, TxB2 и серотонин;

b) изменение морфологии тромбоцитов;

c) высвобождение микрочастиц из тромбоцитов.

Активированные тромбоциты являются протромбогенными. Активация тромбоцитов может быть оценена различными способами, такими как оптическая и электронная микроскопии для исследования морфологии адгезированных на поверхности материала/изделия тромбоцитов, измерение , ТФ-4 и TxB2, высвобожденных из активированных тромбоцитов.

и ТФ-4 являются белками, которые содержатся в альфа-гранулах тромбоцитов и высвобождаются в больших количествах после активации тромбоцитов [85] - [87], [106]. Оба этих белка могут быть измерены с помощью коммерчески доступных тест-наборов ИФА. Повышение активации тромбоцитов может произойти посредством множества путей, связанных с МИ и материалами. Контакт поверхности МИ/материала с кровью, турбулентность и чрезмерные сдвиговые напряжения потока крови могут вызвать активацию тромбоцитов. Активация тромбоцитов может быть вызвана сильными агонистами, например тромбином в процессе тромбообразования при контакте материала/МИ с кровью или из-за локального повреждения стенки кровеносного сосуда. Высокие уровни TxB2, измеряемые ИФА, указывают на высокие уровни своего предшественника тромбоксана A2, сильного агониста тромбоцитов, который считают продуктом активированных тромбоцитов; TxB2 также относят к надежному, независимому от вида животных, маркеру активации тромбоцитов. См. B.3.3.1 и B.4, где подробно изложена общая методология ИФА. Также может быть информативной оценка активации тромбоцитов путем исследования морфологических изменений адгезированных тромбоцитов при их активации на поверхности материала/МИ [70], [71], [173].

B.3.4 Гематология. Методы исследования

B.3.4.1 Общий анализ крови (ОАК)

Общий анализ крови (как правило, называемый ОАК) является жизненно важным исследованием, применяемым ежедневно в больничных гематологических лабораториях. Его основной целью является быстрое и точное измерение концентраций различных популяций клеток в крови пациента, когда абнормальные показатели могут предоставить раннюю и жизненно важную информацию по целому ряду потенциальных отклонений. ОАК используют для определения количества или соотношения лейкоцитов и эритроцитов в организме. Анализ включает подсчет тромбоцитов. При исследовании гемосовместимости материала/изделия данные ОАК предоставляют основную информацию о влиянии взаимодействия изделия/материала с форменными элементами крови. Подсчеты тромбоцитов и лейкоцитов до и после контакта крови с материалом/изделием необходимы для регистрации убыли активированных тромбоцитов и лейкоцитов за счет формирования тромба, индуцированного поверхностью материала/МИ, и, таким образом, позволяют оценить тромбогенный потенциал тестируемых образцов [24].

B.3.4.2 Активация лейкоцитов

Активация лейкоцитов может быть определена микроскопическим исследованием поверхности МИ на предмет активированных лейкоцитов. Простой, более количественный метод включает применение коммерческого тест-набора ИФА для определения количества эластазы полиморфоядерного лейкоцита (ПМЯ), выделенного в плазму после активации, вызванной взаимодействием материала или изделия с кровью. Другой подход, основанный на принципе, что тромбы, прилегающие к материалу, будут содержать большое количество тромбоцитов и лейкоцитов, включает оценку снижения их количества в крови [24].

B.3.5 Система комплемента. Методы исследования на C3a и SC5b-9

Система комплемента существует в плазме крови в форме биохимического каскада, который функционирует как защитный механизм, предназначенный для поддержки или "дополнения" способности антител выводить патогенные агенты из организма. Она является частью иммунной системы, называемой "врожденной иммунной системой". Здесь, в отличие от защиты антителами, активность ответа не приобретается и не адаптируется с течением времени. Система комплемента формирует фундаментальную линию защиты, которая функционирует параллельно и может опосредовать конкретные механизмы антител. Система комплемента тем не менее может быть приведена в действие поверхностью или поверхностями материалов, инородных организму, включая контактирующие с кровью МИ [129], [138].

Система состоит из некоторого количества белков, обнаруживаемых в крови, которые, как правило, циркулируют в качестве неактивных прекурсоров. Белки комплемента обозначаются как "C" с последующей арабской цифрой для нативного белка, а для расщепленного - со строчной "a" или "b", чтобы обозначить фрагмент. В условиях низкого уровня спонтанно образованного реактивного C3b присутствие материала/МИ может запустить ответ амплификации, конечным итогом которого станет выработка медиаторов воспаления, например C5a, и цитотоксичных белковых комплексов, например мембраноатакующий комплекс (МАК), который может стимулировать целый ряд воспалительных ответов, включая хемотаксис лейкоцитов, выработку активных форм кислорода (АФК) и экспрессию цитокинов [129], [130], см. рисунок B.2.

 

Альтернативный путь

 

 

- поверхность биоматериала/изделия

 

Рисунок B.2 - Альтернативный путь комплемента

 

Примечание - Факторы, отмеченные красным, измеримы коммерчески доступными тест-наборами.

 

Существует множество белков и фрагментов белков, которые составляют систему комплемента, и они могут быть разделены по трем путям активации: классический путь комплемента, альтернативный путь комплемента и маннозо-связывающий лектиновый путь. Именно альтернативный путь активации системы комплемента считается наиболее вероятным при контакте медицинских материалов/МИ с кровью.

Доступны несколько коммерческих тест-наборов ИФА для оценки белков системы комплемента в крови. Так как C3a является всегда присутствующим в крови фрагментом, концентрация которого увеличивается при активации системы комплемента, то он считается ее хорошим общим индикатором. Кроме того, растворимая форма терминального МАК - фрагмента SC5b-9 также может быть оценена методом ИФА. Фрагмент SC5b-9, как правило, считают более важным маркером, указывающим на полную степень активации системы комплемента. Повышенные уровни любого из компонентов комплемента указывают на активацию всей системы комплемента. Для изделий с большой площадью поверхности, таких как фильтры для гемодиализа и системы искусственного кровообращения, характерны высокие уровни активированных компонентов комплемента [129] - [138], [143], и этот эффект обусловлен активацией лейкоцитов и секвестрацией лейкоцитов в легких [130], [137].

Измерение фрагментов компонентов комплемента имеет несколько недостатков. Во-первых, тест-наборы ИФА только измеряют компоненты комплемента в жидкой фазе (сыворотка или плазма). Они не регистрируют компоненты комплемента, которые активированы и адсорбированы на поверхности изделия. В зависимости от природы материала/МИ на их поверхности может находиться значительное количество активированных адсорбированных компонентов комплемента, которые не обнаруживаются коммерческими тест-наборами ИФА. Во-вторых, для многих из коммерчески доступных наборов существуют видоспецифичность и высокие базовые/фоновые уровни, наблюдаемые при стандартном исследовании in vitro. В связи с этим следует включить и обосновать необходимые контроли. Классический метод CH-50 применим при исследовании общей активации системы комплемента, индуцированной поверхностью материала/МИ, в сыворотке человека, быка, свиньи и кролика. Тем не менее чувствительность CH-50 при измерении активации комплемента после контакта с материалами/изделиями низкая, учитывая, что методом CH-50 измеряют остаточную активность комплемента и часто только небольшую часть системы комплемента, активируемую материалами/МИ. Другим удобным методом измерения активации комплемента in vitro является регистрация увеличения концентрации C3- или C5-конвертазы комплемента, определяемой конверсией субстрата. В [18] и [19] также приведена информация об активации системы комплемента. В приложении E приведена дополнительная информация об активации системы комплемента, связанной с медицинскими материалами и МИ. См. B.4, где подробно изложена общая методология ИФА.

B.4 Существующие методологии исследования факторов плазмы крови, специфичных для системы свертывания крови, активации тромбоцитов, лейкоцитов и системы комплемента (используя ИФА или аналогичные методы)

B.4.1 Общие положения

Оценка свертывания крови, активации тромбоцитов, других клеток крови и комплемента долгое время основывалась на клинических анализах, измеряющих в плазме уровни ключевых белков, образующихся в процессе каскада активации или высвобождающихся при активации или повреждении различных типов клеток. В таком случае клинические лаборатории часто полагаются на тест-наборы, использующие распространенный метод ИФА. В основном исследовании, которое может быть in vivo или in vitro, использование того или иного метода будет зависеть от наличия соответствующих антител/тест-наборов к видоспецифичным эпитопам-мишеням белка. Пробы крови забирают при определенных условиях, подготавливают и анализируют согласно инструкциям изготовителя тест-наборов. Определенные условия могут включать время контакта материала/изделия с кровью, концентрацию и тип антикоагулянта, температуру, наличие потока, гематокрит и другие факторы. Сравнение результатов с необходимыми контролями, такими как отрицательные контроли (например, базовые уровни или отсутствие контакта материала/МИ с кровью), и результатов для промышленно выпускаемого изделия-аналога является обязательным. Значения параметров активации, которые статистически и биологически значимо выше, чем в контролях, могут означать, что материал/изделие представляет собой более высокий уровень риска для пациента из-за большой вероятности активации системы свертывания, тромбоцитов или комплемента при его контакте с кровью. В примеры белков свертывающей системы, для которых существуют коммерчески доступные тест-наборы ИФА, включают ТАК (комплексы тромбин-антитромбин), F.1.2 (фрагмент белка, высвобождаемый из протромбина при формировании тромбина) и ФПА (фибринопептид A, высвобождаемый из фибриногена при формировании фибрина). Существуют коммерческие наборы ИФА для оценки активации тромбоцитов (например, высвобождение альфа-гранулами и ТФ-4) и активации комплемента (например, формирование C3a и SC5b9).

B.4.2 Общие методы и регистрация результатов анализа

B.4.2.1 Общие положения

В протоколе исследований указывают сведения и прикладывают документацию в соответствии с настоящим разделом.

B.4.2.1.1 Справочные документы

ИП протокола ИФА, прикладываемая изготовителем.

B.4.2.2 Хранение и стабильность

В протоколе указывают условия хранения и стабильности используемых реагентов комплекта и крови/плазмы крови.

B.4.2.3 Процедура

B.4.2.3.1 Приготовление образца

Должны быть предоставлены общие инструкции. Результаты исследования зависят от ПП исследуемого МИ или исследуемого материала МИ. По этой причине следует обозначить отношение ПП к объему крови (значение экспозиционной дозы) в каждом исследовании. Значения экспозиционной дозы от 3,0 см² до 6,0 см²/мл крови (основываясь на толщине изделия) соответствуют значениям, установленным в ISO 10993-12. Другие значения экспозиционной дозы, такие как превосходящие данное отношение в 1,5 и 2,0 раза, допускается использовать, так как более высокие площади поверхности теоретически увеличивают чувствительность реакции крови и ее компонентов на исследуемую поверхность.

Следует указать способ ингибирования реакции после времени инкубации, т.е. привести наименование и концентрацию/концентрации ингибирующего агента/агентов.

B.4.2.3.2 Коэффициент разбавления (КР)

Должна быть предоставлена детальная информация о применяемых коэффициентах разведения, растворителях и т.д.

ВНИМАНИЕ - Может наблюдаться значительная интер- и интрадонорская вариативность, что делает сложным определение единственного идеального КР. Следовательно, рекомендуется использование как минимум двух КР исследуемого образца для того, чтобы охватить все значения проб образца на стандартной кривой абсорбции. Значения абсорбции образца должны быть в диапазоне, обозначенном самым низким и самым высоким стандартами. В противном случае образцы должны быть исследованы повторно с новым КР так, чтобы результаты находились в диапазоне стандартной кривой.

B.4.2.3.3 Выбор данных при исследовании с множественными КР

Если все или некоторые образцы исследовались без разбавления, при низком и высоком разбавлении, для отчета берут значения, требующие наименьшего КР, находящегося на стандартной кривой абсорбции. Допустимо, если образцы "без разбавления" содержат отдельные значения вне кривой, все образцы "низкого разбавления" находятся на кривой, а образцы "высокого разбавления" содержат отдельные значения ниже кривой, для отчета о показателях "низкого разбавления", где все значения находятся на кривой при том же КР.

B.4.2.3.4 Приготовление стандартов

Подробно описывают процедуры получения стандартной кривой и приготовления контролей.

B.4.2.3.5 Метод

Подробно описывают последовательные этапы выполнения метода в целом, включая информацию о каких-либо отступлениях от ИП набора ИФА.

B.4.2.3.6 Оценка

Подробно описывают выполненные вычисления для определения значений концентраций измеряемого белка в плазме крови.

B.4.2.3.7 Статистический анализ

Подробно описывают методы статистического анализа.

B.4.2.3.8 Ограничения и ошибки

Должны быть приведены все ограничения или ошибки, такие как неправильная методика забора крови; например, неправильное соотношение образца крови и раствора цитрата (или другого антикоагулянта, такого как гепарин) может привести к ложно завышенным значениям белка системы свертывания крови; неправильно выбранный антикоагулянт может привести к повышению всех фоновых значений и т.д.

B.4.2.3.9 Сравнительный интервал

Должны быть приведены известные нормальные и абнормальные концентрации измеряемого белка в плазме и ожидаемые значения контролей.

B.4.3 Приложения

Должна быть приведена информация по рекомендуемому коэффициенту разбавления, формы данных пробы ИФА, контрольные листы для выполненного метода ИФА и т.д.