ГОСТ Р 58138-2018. Национальный стандарт Российской Федерации. Удобрения органические. Методы паразитологического анализа. Методы определения личинок синантропных мух

8 Методы определения наличия яиц, личинок и куколок синантропных мух

 

Примечание - Описание личинок и куколок синантропных мух приведено в [3].

 

8.1 Визуальный метод определения личинок и куколок синантропных мух

 

Метод основан на установлении наличия яиц, личинок и куколок синантропных мух в образцах органических удобрений и навоза при просмотре под лупой или микроскопом, используя соответствующий определитель <*>.

--------------------------------

<*> См. [4].

 

8.1.1 Пробу массой 10 г по частям перемещают в чашки Петри и просматривают под лупой или микроскопом, перебирая содержимое препаравальной иглой и пинцетом. Найденные при исследовании яйца, личинки и куколки мух собирают отдельно, используют для дальнейшего культивирования и видовой идентификации.

Яйца синантропных мух имеют размеры 1 x 0,8 мм, личинки 1-го возраста длиной 2 мм, 2-го возраста - 4 мм и 3-го возраста - от 1 до 2 см, куколки - от 0,8 до 1,4 см.

 

8.2 Ларвоскопические методы определения личинок синантропных мух

 

Ларвоскопические методы основаны на выделении личинок синантропных мух в навозе от разных видов животных и в определении по ним видовой принадлежности. Методы ларвоскопии для определения личинок синантропных мух по исполнению несложные. Пробы навоза обрабатывают различными способами, выделяют личинок синантропных мух разного возраста, которых исследуют под лупой или микроскопом.

8.2.1 Метод Бермана-Орлова для определения личинок синантропных мух

Из доставленных в лабораторию проб навоза отбирают 10 г, заворачивают в кусочек марли и помещают в воронку на металлическое сито. Предварительно в воронку наливают дихлорированную воду температурой 40 °C. Заполненный пробами навоза и водой аппарат оставляют при комнатной температуре на 3 ч. Лучше материал заложить в конце рабочего дня и оставить до утра следующего дня. Ввиду того что личинки мух обладают термотропностью, они перемещаются из пробы навоза в теплую воду и оседают на дно пробирки. Перед исследованием пробирки осторожно разъединяют с резиновой трубкой и быстрым движением, не встряхивая осадок на дне, сливают жидкость из пробирки до осадка. Таким образом снимают все пробирки в аппарате и ставят их в штатив. Осадок разливают на часовые или предметные стекла и микроскопируют. При осмотре под микроскопом личинки мух подвижные, поэтому их легко найти.

Эффективность данного метода для выявления личинок мух составляет более 90%.

8.2.2 Метод Вайда для установления наличия личинок синантропных мух разного возраста

Метод достаточно прост. На часовое или предметное стекло кладут 5 г навоза, взятого из навозохранилища, и добавляют небольшое количество теплой воды (приблизительно 40 °C). По истечении 40 мин навоз удаляют, оставшуюся жидкость на стекле исследуют под микроскопом на наличие личинок синантропных мух. Эффективность этого метода для выявления личинок синантропных мух разного возраста при интенсивной инвазии составляет 70%.

8.2.3 Метод Шильникова представляет собой упрощенный метод Бермана, который прост и удобен для выполнения в любых условиях. Для постановки проб используют обыкновенные медицинские градуированные стаканчики емкостью 30 см³, имеющие форму усеченного конуса и сферическое дно, выпуклость дна направлена кверху. Пробы навоза от 5 до 10 г заворачивают в марлевые салфетки, раскладывают по стаканчикам, заливают теплой водой и оставляют на 8 - 10 ч, причем предпочтительнее закладывать пробы в стаканчики в конце рабочего дня и утром следующего дня исследовать. По истечении отмеченного времени пробы осторожно вынимают, а жидкость отстаивают в течение от 10 до 15 мин. Затем стаканчики медленно наклоняют, сливают воду до появления мути и дают отстояться остатку жидкости на протяжении от 5 до 10 мин. После этого стаканчик наклоняют и из него пипеткой отсасывают верхний прозрачный слой воды до тех пор, пока в пипетку не начнет всасываться осадок на дне. После удаления лишней воды на дне стаканчика остается от 0,5 до 1 см³ жидкости, которую пипеткой каплями наносят на предметное или часовое стекло и исследуют под микроскопом.

Когда в стаканчике получается густой осадок, наливают воду, осадок взбалтывают, дают отстояться в течение от 10 до 15 мин, а затем воду сливают. Осадок лучше просматривать порциально, каплями, так как при этом затрачивается меньше времени и концентрация личинок на единицу площади в них довольно большая.

Эффективность метода для выявления личинок синантропных мух разного возраста приближается к методу Бермана и составляет 80%.

 

8.3 Седиментационные методы определения личинок и куколок синантропных мух

 

Седиментационные методы основаны на осаждении личинок и куколок синантропных мух в процессе обработки проб навоза дистиллированной водой или другими жидкостями и исследовании осадка.

Данные методы применяют для определения личинок и куколок синантропных мух в навозе жвачных животных, реже - других животных.

8.3.1 Метод последовательного промывания для определения личинок и куколок синантропных мух в навозе жвачных животных

В навозе крупного рогатого скота помимо яиц гельминтов, цист паразитических простейших (букстонеллы), ооцист кокцидий могут содержаться личинки и куколки мух. Анализируемую пробу навоза массой 5 г помещают в стакан вместимостью от 50 до 100 см³, вливают небольшое количество дистиллированной воды и палочкой размешивают до получения жидкой кашицеобразной массы, затем добавляют дистиллированную воду порциями до объема 50 см³ при постоянном размешивании.

Смесь фильтруют, пропуская через ситечко в другой стакан, и отстаивают в течение 5 мин до образования осадка, после чего верхний слой жидкости сливают до осадка, а к осадку добавляют снова такое же количество дистиллированной воды и отстаивают в течение 5 мин, после чего жидкость снова сливают до осадка.

Такие операции повторяют до тех пор, пока надосадочный слой воды не будет прозрачным. Последний раз верхний слой сливают или отбирают спринцовкой, опустив наконечник в стакан, не доводя до дна от 1,5 до 2,0 см, а осадок поочередно разливают на часовые или предметные стекла и исследуют под лупой или микроскопом. Найденные при исследовании личинки и куколки синантропных мух собирают отдельно в чашки Петри для культивирования с помощью пипетки, а для подсчета и хранения с помощью пинцета. Хранят личинок мух в 70-градусном этиловом спирте в колбах с плоским дном.

8.3.2 Метод формалин-эфирной или уксусной седиментации

В основе методов седиментации (осаждения) лежит разность удельного веса используемых химических реактивов и личинок и куколок синантропных мух, удельный вес которых высокий, и они концентрируются в осадке.

Следует тщательно перемешать пробу навоза массой 5 г с 10%-ным раствором формалина в стакане вместимостью от 50 до 100 см³. В центрифужную пробирку необходимо поместить воронку, на нее - два слоя марли (можно также использовать металлические или пластмассовые ситечки). Следует профильтровать не менее 8 мл суспензии из чашки (если объем фильтрата будет меньше, необходимо добавить 10%-ный раствор формалина не более 8 мл). Должны долить в пробирку 2 мл эфира и закрыть пробкой. Далее следует энергично встряхивать пробирку не менее 30 с, после чего центрифугировать при 1500 об/мин в течение 2 мин или 2000 об/мин в течение 1 мин. После центрифугирования образуются четыре слоя: осадок, раствор формалина, коагулированный белок, фекальный детрит - "пробка", а сверху эфир с растворенными в нем жирами. Верхние три слоя необходимо удалить опрокидыванием пробирки, пипеткой отобрать нижнюю часть осадка, поместить на предметное стекло и микроскопировать при малом, затем при большом увеличении. В методе формалин-эфирной седиментации формалин можно заменить 5%-ным водным раствором уксусной кислоты. Ход исследования остается без изменений.

 

8.4 Флотационные методы

 

Флотационные методы основаны на определении наличия яиц и личинок синантропных мух, всплывающих на поверхность флотационного раствора с испытуемым материалом, с помощью микроскопа.

При определении наличия личинок синантропных мух под микроскопом используют соответствующий определитель <*>.

--------------------------------

<*> См. [3].

 

8.4.1 Метод Фюллеборна для определения личинок синантропных мух

Анализируемую пробу массой 3 г заливают в ступке 10 см³ насыщенного раствора хлористого натрия по 7.1.1, тщательно размешивают стеклянной палочкой и по мере размешивания добавляют раствор, доводя раствор до 45 см³. Затем процеживают через крупноячеистое сито в чистый стакан и отстаивают в течение 30 мин. За время флотации личинки синантропных мух, удельный вес которых меньше веса насыщенного раствора хлористого натрия, всплывают на поверхность и концентрируются на поверхностной пленке.

Затем, прикасаясь металлической петлей к разным местам поверхностной взвеси, снимают три капли раствора, наносят на предметное стекло и исследуют под микроскопом. Для недопущения быстрого высыхания и кристаллизации капель на предметных стеклах к ним добавляют по небольшой капле 50%-ного водного раствора глицерина.

Металлическую петлю обжигают над пламенем спиртовки в начале и конце испытаний. При массовых исследованиях каплю на предметном стекле покровным стеклом не накрывают, а металлическую петлю промывают резкими движениями в стаканчике с дистиллированной водой.

8.4.2 Метод Котельникова-Хренова для определения личинок синантропных мух

Исследования проводят с помощью флотационного раствора нитрата аммония по 7.1.2 с изменением времени отстаивания после фильтрования жидкости до 10 - 15 мин.

8.4.3 Комбинированный флотационный метод для определения личинок синантропных мух

Исследования проводят с помощью комбинированного флотационного раствора по 7.1.4 с изменением времени отстаивания после фильтрования жидкости до 10 - 15 мин.

 

8.5 Комбинированные (седиментационно-флотационные) методы

 

Комбинированные (седиментационно-флотационные) методы основаны на комбинации противоположных приемов обработки проб навоза - седиментации и флотации, благодаря чему происходит обогащение осадка или поверхностной пленки личинками мух и удаление излишних посторонних частиц взвеси, которые значительно мешают исследованию.

Методы более трудоемкие, однако для обнаружения некоторых личинок мух более информативные.

8.5.1 Метод Черепанова

Лабораторные пробы жидкого навоза, жидкой фракции и иловой смеси отстаивают, сливают надосадочный слой, осадок промывают и удаляют грубые включения через двойной марлевый фильтр. Если первичное промывание осадка проводят на месте отбора проб, то его сразу переносят в центрифугу, добавляют чистую воду и в течение 2 - 3 мин центрифугируют при 1000 об/мин. Твердую фракцию обрабатывают и исследуют по той же методике, что и осадок. После центрифугирования жидкость сливают, а осадок исследуют с применением центрифужного флотационного метода. Перед центрифугированием пробирки с анализируемыми пробами уравновешивают на специальных (прибор типа GWG) или приспособленных для этой цели весах, добавляя при необходимости соответственно насыщенный раствор соли или воду, и устанавливают в гнезда ротора центрифуги. Объем одной анализируемой пробы в расчете на центрифужную пробирку емкостью 250 см³ составляет 100 см³ для твердой фракции и от 25 до 50 см³ для осадка.

К осадку, находящемуся в центрифужных пробирках (после его центрифугирования с водой), добавляют не более 150 см³ насыщенного раствора нитрата натрия по ГОСТ 4168 или хлорида натрия по ГОСТ 4233. После перемешивания стеклянной палочкой смесь центрифугируют в течение 3 мин при 1000 - 1500 об/мин.

По окончании центрифугирования в пробирки добавляют тот же по объему насыщенный раствор соли до образования выпуклого мениска и накрывают большими предметными стеклами размерами 70 x 70 мм по ГОСТ 9284. Стекла предварительно обезжиривают смесью спирта по ГОСТ 5962 и эфира или нашатырным спиртом по ГОСТ 3760 либо моют в горячей воде порошком, обладающим дезинфицирующим свойством. Обрабатывают обе стороны стекол и просушивают. На сухой поверхности стекол стеклографом наносят три-четыре тонких линии, делящих ее на равные части.

Стекла с пробирок снимают через 20 мин. Просматривают под микроскопом пленку жидкости, образующуюся на их поверхности, соприкасавшейся с раствором. Покрытие пробирок стеклами и микроскопирование повторяют два-три раза. Для просветления пленки и предотвращения выпадения в ней кристаллов на ее поверхность наносят три-четыре капли водного раствора глицерина по ГОСТ 6259 и дистиллированной воды по ГОСТ 6709 в соотношении 1:1.

8.5.1.1 Анализируемые пробы обычного твердого (подстилочного) навоза и помета компостов, биоперегноя и биогумуса массой от 50 до 100 г помещают в лабораторный стакан по ГОСТ 25336. В него добавляют дистиллированную воду по ГОСТ 6709. Содержимое в стакане перемешивают и фильтруют через двойной марлевый фильтр в другой стакан или колбу конической формы. Фильтрат отстаивают в течение от 15 до 20 мин или переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 3 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют насыщенный раствор нитрата натрия по ГОСТ 4168 или других солей и смесь вновь центрифугируют в том же режиме. Центрифужные пробирки устанавливают в штатив, в них добавляют насыщенный раствор соли до образования выпуклого мениска, поверх которого кладут покровные стекла. Через 15 - 20 мин стекла снимают, поворачивая внутренней стороной вверх, и образовавшуюся пленку просматривают под микроскопом под малым увеличением на предмет обнаружения личинок синантропных мух.

В процессе микроскопирования подсчитывают количество обнаруженных личинок синантропных мух в анализируемой пробе. Затем подсчитывают их количество на единицу объема анализируемой массы - на 1 - 10 дм³ жидкого навоза или жидкой фракции, 100 - 1000 см³ или на 1 кг твердой фракции навоза данной влажности.

8.5.2 Экспресс-метод паразитологического анализа бесподстилочного навоза (помета)

Берут от 25 до 50 см³ осадка бесподстилочного навоза (помета), полученного после первичного отстаивания проб по 6.3.3, удаляют из него грубые включения путем промывания, переносят осадок на марлевый или капроновый фильтр. Промывают его 200 см³ насыщенного раствора нитрата натрия, поваренной соли по ГОСТ 4233 или аммиачной селитры. Оставшуюся в осадке на фильтре влагу тщательно отжимают в те же емкости. Фильтрат выдерживают в течение от 15 до 20 мин, после чего поверхностную пленку жидкости переносят паразитологической петлей на предметные стекла и просматривают под микроскопом. Можно пользоваться и большими предметными обезжиренными стеклами, накрывая их поверх мениска флотационного раствора.

Метод менее точен, чем центрифужный, однако более прост по исполнению, не требует сложного оборудования и может быть применим для экспресс-диагностики загрязнения бесподстилочного навоза (помета) личинками синантропных мух.

Для выполнения указанного метода применяют стаканы для фильтрата по ГОСТ 25336, насыщенного раствора соли, предметные стекла по ГОСТ 9284, марлю по ГОСТ 9412 или капроновую ткань с ячейками 0,1 мм и микроскоп.

8.5.3 Метод Дарлинга

Анализируемую пробу массой 5 г помещают в стакан вместимостью от 50 до 100 см³, заливают 10 см³ дистиллированной воды, тщательно размешивают, добавляя дистиллированную воду не более 45 см³. Затем полученную взвесь процеживают через сито в стакан и отстаивают в течение 5 мин. После отстаивания верхний слой жидкости сливают, а на дне оставляют осадок с водой, который переносят в центрифужную пробирку.

Наполненные до одинакового уровня пробирки центрифугируют с частотой вращения 2000 об/мин в течение 2 мин. После чего жидкость из пробирок сливают, а к осадку добавляют 10 см³ флотационного раствора натрия хлористого по 7.1.1, тщательно перемешивают до получения взвеси и опять центрифугируют в течение 2 мин.

Затем металлической петлей снимают из каждой пробирки по три капли поверхностной взвеси, переносят на предметное стекло и препарат исследуют под микроскопом.

8.5.4 Метод Щербовича

Испытания проводят по 8.5.3, а в качестве флотационного раствора используют насыщенный раствор сульфата магния по 7.1.5.

8.5.5 Метод Вишняускаса

Применяют для определения яиц и личинок синантропных мух в пробах навоза.

Анализируемую пробу навоза массой 5 г тщательно размешивают с 50 см³ дистиллированной воды в стакане, затем фильтруют через сито в стеклянную посуду вместимостью 100 см³. Стакан прополаскивают несколько раз 50 см³ дистиллированной воды, которой промывают навоз на сите. 100 см³ полученного фильтрата отстаивают в течение 5 мин, затем верхний слой жидкости отбирают спринцовкой или осторожно сливают, оставляя на дне 20 см³ жидкости с осадком.

К жидкости с осадком добавляют 80 см³ дистиллированной воды и вновь отстаивают в течение 5 мин. После чего надосадочную жидкость отбирают спринцовкой или сливают, оставляя на дне 10 см³ жидкости, которую перемещают в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 1 мин при 1500 об/мин.

Затем верхний слой жидкости отбирают спринцовкой или сливают, оставляя только осадок. К осадку постепенно добавляют раствор сульфата цинка по 7.1.6 таким образом, чтобы мениск жидкости образовался выше краев центрифужной пробирки. Центрифужную пробирку покрывают покровным стеклом так, чтобы жидкость всей своей поверхностью соприкасалась с покровным стеклом. Заблаговременно перед началом испытания края центрифужных пробирок шлифуют на бруске. Центрифугируют в течение 0,5 мин при 1500 об/мин.

Яйца и личинки синантропных мух всплывают и прилипают к покровному стеклу. Покровное стекло с яйцами и личинками мух снимают и помещают на предметное стекло, предварительно нанеся одну каплю дистиллированной воды, и исследуют под микроскопом.