ГОСТ Р 57989-2017. Национальный стандарт Российской Федерации. Продукция пищевая специализированная. Методы выявления патогенных микроорганизмов на основе полимеразной цепной реакции

9 Оценка жизнеспособности патогенных микроорганизмов в анализируемых пищевых продуктах

 

9.1 При положительных результатах ПЦР-анализа проб нативных пищевых продуктов или культуральной жидкости, свидетельствующих об обнаружении ДНК искомых патогенных бактерий, необходимо подтвердить наличие в пробе жизнеспособных микроорганизмов - одновременно с выполнением анализа методом ПЦР-FRT или методом культурального посева.

9.2 Для оценки жизнеспособности целевого микроорганизма в ходе ПЦР-анализа сопоставляют результаты одновременного тестирования методом ПЦР-FRT парных образцов одного и того же продукта, подвергавшихся и не подвергавшихся инкубации после посева на этапе пробоподготовки по 6.4.2. Для оценки жизнеспособности микроорганизмов может применяться только ПЦР-FRT.

Результаты ПЦР, регистрируемые в процессе реального времени и показывающие различия в значениях Ct (пороговых циклов амплификации) для парных образцов на три единицы и более (Ct_{не инк.} - Ct_инк. >= 3, Ct_{не инк.} - цикл амплификации не инкубированного образца, Ct_инк. - цикл инкубированного образца), свидетельствуют о наличии в продукте живых (неинактивированных) клеток микроорганизма.

Интерпретацию результатов проводят согласно таблице 1.

 

Таблица 1

 

Результат ПЦР-анализа инкубированного образца	Результат ПЦР-анализа замороженного образца	Интерпретация результатов
Положительный	Положительный	Жизнеспособный возбудитель
Положительный	Отрицательный	Жизнеспособный возбудитель
Отрицательный	Положительный	Нежизнеспособный возбудитель
Отрицательный	Отрицательный	Возбудитель не выявлен

 

9.3 Для оценки жизнеспособности целевого микроорганизма допускается выделение чистой культуры искомого патогена (о присутствии которого в пробе свидетельствуют положительные результаты ПЦР-FEP или ПЦР-FRT) из анализируемого материала культуральным методом.

При исследовании проб обогащенных пищевых продуктов в селективных питательных средах по 6.4.1 проводят прямой посев в количестве 0,1 см³ на поверхность соответствующих агаризованных селективно-дифференциальных сред, используемых для выделения патогенных бактерий, указанных в 6.5.1, используют не менее двух сред.

При исследовании проб нативных пищевых продуктов, отобранных при расследовании вспышек по 6.6, одновременно проводят:

а) прямой посев на поверхность соответствующих агаризованных селективно-дифференциальных сред по 9.3.2;

б) посев по 0,1 - 1,0 см³ в 10 см³ соответствующих жидких питательных сред для селективного обогащения по 6.3.2 - 6.3.7. После инкубирования сред производят пересев на поверхность агаризованных селективно-дифференциальных сред по 6.5.1.

На данном этапе допускается проведение посева методом парных проб по 6.4.2 с приготовлением контрольного образца, подвергающегося замораживанию при минус 20 °C и не подлежащего инкубации.

9.4 Посевы на агаризованных средах начинают просматривать через 16 - 18 ч, затем через 24 ч и 48 ч. При обнаружении роста характерных колоний (или газона культуры) их обрабатывают по 6.5 и анализируют путем постановки ПЦР по разделу 8 или методами традиционного биохимического и серологического типирования по ГОСТ ISO 10272-1, ГОСТ 31659, ГОСТ 32010, ГОСТ 32031, [8] на принадлежность к родам, видам, серотипам искомых патогенных бактерий.

Для подтверждения принадлежности культур к искомым патогенным бактериям могут применяться мультимикротесты для биохимической идентификации по 4.3.2.

9.5 При анализе бактериальных культур по 6.5 подтверждение жизнеспособности не требуется.