ГОСТ Р 57989-2017. Национальный стандарт Российской Федерации. Продукция пищевая специализированная. Методы выявления патогенных микроорганизмов на основе полимеразной цепной реакции

6.6 Подготовка проб нативных пищевых продуктов к ПЦР-анализу

6.6.1 Пробы пищевых продуктов, предназначенные для анализа в нативном виде при расследовании вспышек пищевых бактериальных отравлений и инфекций с пищевым путем передачи, подлежат первичной обработке в зависимости от консистенции: путем концентрирования (для жидких продуктов) или перевода в жидкую фазу с последующим концентрированием (для сухих или твердых продуктов).

6.6.2 Концентрирование проб жидкой консистенции объемом до 50 см³ путем центрифугирования проводят в условиях асептики по одному из двух режимов:

- одномоментно при 6000 об/мин в течение (18 +/- 2) мин;

- дробно при 1000 об/мин в течение 5 мин для осаждения крупных частиц и при 6000 об/мин в течение 15 мин.

По окончании центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 5 см³ 0,9%-ного фосфатного буферного раствора NaCl по 5.1.4 и ресуспендируют.

Для экстракции ДНК отбирают 1 см³ взвеси в пробирку типа эппендорф вместимостью 1,5 см³; оставшаяся часть подготовленной пробы используется для посева на питательные среды.

6.6.3 Концентрирование проб жидкой консистенции объемом до 50 см³ путем мембранной фильтрации проводят в два этапа:

1) с использованием стерилизованных ватно-марлевых или бумажных фильтров для освобождения от крупных частиц во избежание засорения мембранных фильтров;

2) через мембранные фильтры N 3 с величиной пор 600 - 800 нм.

Для фильтрования через мембранные фильтры используют предварительно простерилизованные фильтровальные аппараты (системы), подключенные к вакуумному насосу, или фильтрующие насадки на шприц соответствующей вместимости.

Перед началом фильтрования мембранные стерильные фильтры с соблюдением правил асептики закрепляют в аппарате матовой стороной вверх. Фильтрование проводят дробно, пропуская через каждый фильтр не более 25 см³ жидкости, подвергнутой на первом этапе фильтрации через ватно-марлевый или бумажный фильтр.

После окончания фильтрации фильтрат удаляют, а все использованные фильтры переносят в стерильную чашку Петри, измельчают стерильными ножницами и заливают 5 - 6 см³ стерильного изотонического раствора натрия хлористого для десорбции бактерий.

Из полученного смыва отбирают 1 см³ в пробирку типа эппендорф вместимостью 1,5 см³ для экстракции ДНК, оставшаяся часть подготовленной пробы используется для посева на питательные среды.

6.6.4 Пробы пищевых продуктов твердой консистенции и сухих массой 25 - 50 г в условиях асептики предварительно измельчают ножницами, растирают в фарфоровой ступке или в гомогенизаторе при добавлении ФБР по 5.1.3 или стерильной деионизированной воды в соотношении 1:5 или 1:10 для получения 10 - 20% концентрации продукта. Смесь доводят до гомогенного состояния.

Полученную суспензию отстаивают 3 - 10 мин для осаждения грубых частиц, жидкую фазу центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин.

Если полученный осадок вязкий, из него отбирают 1 см³ для экстракции ДНК в пробирку типа эппендорф емкостью 1,5 см³ и не менее 2 см³ - для посева на питательные среды; если плотный - предварительно ресуспендируют в 0,2 - 0,5 см³ стерильной деионизированной воды.

6.6.5 Подготовленные по 6.6.2 - 6.6.4 пробы хранению не подлежат и используются для экстракции ДНК сразу после окончания пробоподготовки.