ГОСТ Р 57989-2017. Национальный стандарт Российской Федерации. Продукция пищевая специализированная. Методы выявления патогенных микроорганизмов на основе полимеразной цепной реакции

6.5 Подготовка штаммов бактериальных культур к ПЦР-анализу

6.5.1 При идентификации культур, выделенных из пищевых продуктов, используют изолированные колонии, характерные для патогенных микроорганизмов, указанных в 4.4, полученные на чашках с селективными агаризованными средами после соответствующего обогащения, в том числе для бактерий:

- рода Salmonella - с ксилоза-лизин-дезоксихолатным агаром, висмут-сульфитным агаром, средой Плоскирева, Эндо, Левина, бриллиантовым зеленым агаром;

- рода Shigella - средой Плоскирева, дезоксихолат-цитратным агаром с лактозой и сахарозой, сальмонелла-шигелла (SS) агаром;

- рода Cronobacter (E. sakazakii) - фиолетово-красным желчным агаром с глюкозой (VRBG agar), средой Эндо;

- энтерогеморрагических E. coli 0157:H7 и других серотипов (ЕНЕС) - сорбитол E. coli 0157:H7 агаром, флуорокульт E. coli 0157:H7 агаром, сорбитол Мак-Конки агаром (SMAC), средой Эндо;

- рода Campylobacter - селективным агаром Престона, угольным селективным агаром для кампилобактерий, колумбийским агаром;

- вида L. monocytogenes - агаром Оттавиани - Агости (ALOA), ПАЛКАМ-агаром (полимиксин-акрифлавин-лития хлорид-цефтазидим-эскулин-маннитол агаром), оксфордским агаром, ПАЛ-агаром.

6.5.2 Не менее трех характерных колоний для бактерий родов Salmonella, Shigella, серотипа E. coli 0157:H7, вида L. monocytogenes отбирают с одной или нескольких указанных в 6.5.1 селективных сред, производят посев штрихом на поверхность плотных питательных сред МПА или ТСАДЭ по 5.2.3 в отдельных чашках Петри или в пробирки с жидкими средами (МПБ или ТСБДЕ) и инкубируют в течение (22 +/- 2) ч при (37 +/- 1) °C.

Изоляты, предположительно относящиеся к роду Campylobacter, засевают на поверхность кровяного колумбийского агара или в бульон для бруцелл и инкубируют при (42 +/- 1) °C в течение 24 - 48 ч в микроаэрофильной атмосфере.

Изоляты, предположительно относящиеся к Cronobacter (E. sakazakii), пересевают на поверхность ТСАДЭ и термостатируют при температуре 25 °C в течение 72 ч.

6.5.3 Для выявления ЕНЕС, фенотипически неотличимых на селективно-дифференциальных средах от других представителей рода Escherichia, необходимо увеличить количество тестируемых колоний до десяти, с применением метода пулирования колоний. Для этого используют стерильный иммунологический планшет, в 77 ячеек которого (лунки 1 - 11, A - G) вносят по 0,2 см³ питательного бульона. Крайний правый и нижний ряды лунок оставляют пустыми. Намеченные для исследования колонии петлей снимают и переносят в отдельные лунки планшета, содержащие питательный бульон. После инкубирования в течение 4 - 6 ч проводят пулирование образцов. Аликвоты объемом 0,01 см³ из каждой лунки в ряду переносят в крайнюю пустую лунку (лунка 12). Эту операцию проводят в каждом ряду лунок (A, B, C, D, E, F, G). Аналогично пулируют образцы по каждому столбцу лунок (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11). Объединенные ("стоковые") образцы из крайнего правого и нижнего ряда лунок тестируют методом ПЦР. Лунки, содержащие чистую культуру ЕНЕС, выявляют с учетом пересечения положительных результатов в тестированных "стоковых" образцах. Выделенные чистые культуры ЕНЕС подвергают дальнейшему анализу.

6.5.4 Бактериальные культуры могут быть представлены для ПЦР-анализа в пробирках на агаризованной среде в соответствии с СП 1.2.036-95. В этом случае производят проверку штамма на чистоту путем микроскопирования, пересевают его в пробирки с ТСБДЭ или другими средами, предназначенными для обогащения данного патогена, и инкубируют в течение 24 ч при (37 +/- 1) °C.

6.5.5 Культуры, полученные по 6.5.2 на плотных питательных средах, смывают с поверхности агара небольшим количеством стерильного физиологического раствора (или снимают петлей) и переносят в стеклянную пробирку. Концентрацию бактериальных клеток в суспензии проверяют по оптическому стандарту МакФарланда. Плотность суспензии должна составлять не менее 1,5 - 2,0 ед. по шкале МакФарланда. При использовании отраслевого стандарта для визуальной оценки мутности N 10 концентрация клеток в пробе должна составлять не менее 10⁷ кл/см³.

Аналогичным образом устанавливают плотность культур на жидких средах. Содержимое пробирки тщательно перемешивают на встряхивателе типа "вортекс" для получения гомогенной суспензии.

Для ПЦР-анализа используют полученные суспензии микроорганизмов или бульонные культуры, содержащие не менее 10⁷ клеток/см³, которые подвергают дальнейшим манипуляциям для выделения ДНК. Подготовленные пробы анализируют в тот же день.