ГОСТ Р 57989-2017. Национальный стандарт Российской Федерации. Продукция пищевая специализированная. Методы выявления патогенных микроорганизмов на основе полимеразной цепной реакции

6.3 Посев в среды обогащения

6.3.1 Подготовленные по 6.2 пробы засевают в жидкие питательные среды и инкубируют для подращивания находящихся в пищевых продуктах патогенных бактерий и накопления их биомассы.

Материалом для дальнейшего анализа в ПЦР служат пробы культуральной жидкости, представляющей собой биомассу искомых микроорганизмов с совокупностью образованных ими продуктов метаболизма в питательных средах для селективного обогащения, полученную при оптимальных для данных микроорганизмов режимах инкубации.

6.3.2 Первичный посев пищевых продуктов для накопления бактерий рода Salmonella проводят в неселективную жидкую среду ЗПВ по 5.1.5, подогретую до (37 +/- 1) °C, при соотношении продукта и среды не менее 1:9. Например, пробу массой 25 г засевают в 225 см³ ЗПВ, 50 г - в 450 см³ ЗПВ и т.п. Инкубируют в течение (18 +/- 2) ч.

По окончании инкубации в ЗПВ проводят вторичное обогащение параллельно в двух жидких селективных средах: в среде Раппапорта - Вассилиадиса с соей по 5.3.10 и в одной из двух сред - в селенитовом бульоне по 5.3.9 или в МКТ-бульоне по 5.3.11 Для этого по 1 см³ инокулята из ЗПВ пересевают в 10 см³ каждой из указанных сред. Посевы в RVS-бульоне инкубируют при (41,5 +/- 1) °C в течение 24 ч, в селенитовом бульоне и МКТ-бульоне - при (37 +/- 1) °C в течение 24 ч.

Допускается высевать пробы свежих пищевых продуктов, не содержащих сублетально поврежденных бактерий рода Salmonella в результате сушки, замораживания, непосредственно в селективные среды, минуя этап неселективного обогащения, при соотношении продукта и среды не менее 1:9, при тех же режимах инкубации.

Для ПЦР-анализа используют культуральную жидкость RVS-бульона и одной из двух сред - селенитового бульона или МКТ-бульона.

6.3.3 Посев пищевых продуктов для накопления бактерий рода Shigella проводят непосредственно в среды селективного обогащения - в селенитовый бульон в модификации Лейфсона по 5.3.9 и в бульон для бактерий рода Shigella по 5.3.12, используя соотношение 1:9. Посевы инкубируют в термостате при температуре (37 +/- 1) °C в течение (18 +/- 2) ч. Дальнейшая инкубация может привести к ингибиции роста бактерий рода Shigella, чувствительных к накоплению кислых продуктов метаболизма.

Для ПЦР-анализа используют культуральную жидкость обеих селективных сред.

6.3.4 Первичный посев пищевых продуктов для неселективного накопления энтерогеморрагических E. coli, в том числе серотипа 0157:H7, проводят аналогично посеву на бактерии рода Salmonella, при соотношении продукта и среды 1:9, засевая по 25 г пробы в 225 см³ неселективной жидкой среды ЗПВ по 5.1.5, подогретой до (37 +/- 1) °C. Инкубируют при этой температуре в течение (18 +/- 2) ч.

По окончании инкубации в ЗПВ проводят вторичное обогащение, для чего по 1 см³ инокулята пересевают параллельно в пробирки с 10 см³ жидких селективных сред с лактозой по 5.3.7 и 5.3.8.

Молочные продукты подлежат посеву только в среду Кесслер с лактозой.

Посевы термостатируют при (37 +/- 1) °C в течение (22 +/- 2) ч.

Допускается высевать пробы пищевых продуктов (мяса и субпродуктов сырые, жира-сырца, крови, сырья кишечного и коллагенсодержащего, молока сырого, цельномолочной продукции, в том числе творога и сыра, плодоовощной продукции), не содержащих сублетально поврежденных энтерогеморрагических E. coli в результате сушки или замораживания, непосредственно в селективные среды, минуя этап неселективного обогащения, при соотношении продукта и среды не менее 1:9, при тех же режимах инкубации.

Для ПЦР-анализа используют культуральную жидкость любой из вышеуказанных селективных сред.

С целью подтверждения отсутствия энтерогеморрагических E. coli в массе продукта, в которой нормируется отсутствие E. coli (продукты и блюда общественного питания, сырокопченые и сыровяленые мясные изделия), посев производят по ГОСТ 30726. При этом подготовленные по 6.2 продукты нормируемой массы или их соответствующие децимальные разведения в ЗПВ засевают непосредственно в пробирки с селективными средами с лактозой по 5.3.7 или 5.3.8. Посевы проверяют на наличие признаков роста через (22 +/- 2) ч инкубации при (37 +/- 1) °C, отмечая образование кислоты и газа из лактозы (при отсутствии признаков роста инкубируют посевы еще 24 ч), после чего используют для ПЦР-анализа.

6.3.5 Первичный посев пищевых продуктов для детей раннего возраста (молочные смеси и продукты прикорма сухие), а также специализированные продукты для лечебного и профилактического питания детей первого года жизни, подлежащие контролю на наличие Cronobacter spp. (E. sakazakii) согласно [9], проводят в неселективные жидкие среды, исходя из соотношения продукта и среды 1:9.

К пробе массой (300 +/- 1) г добавляют 2,7 дм³ ФБР по 5.1.3 или ЗПВ по 5.1.5, подогретой до (37 +/- 1) °C, термостатируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (18 +/- 2) ч.

По истечении инкубации в ФБР или ЗПВ проводят вторичное обогащение, для чего по 10 см³ суспензии пересевают в 90 см³ жидких селективных сред для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae - среду Кесслер с глюкозой (см. 5.3.4), или глюкозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью (см. 5.3.5), или бульон Мак-Конки (см. 5.3.6). Посевы термостатируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (22 +/- 2) ч.

Для ПЦР-анализа используют культуральную жидкость не менее чем из двух указанных выше питательных сред для селективного обогащения.

6.3.6 Посев пищевых продуктов для накопления бактерий рода Campylobacter проводят непосредственно в среду селективного обогащения.

К необходимому количеству подготовленной по 6.1.4 и 6.2.5 пробы добавляют девятикратный объем селективного бульона Престона по 5.3.13 или селективного бульона Дойла по 5.3.14. При анализе жировых молочных продуктов седимент, приготовленный согласно 5.2.7, предварительно растворяют в 10 см³ обогащающего бульона и добавляют к остальному объему среды. Полученную взвесь инкубируют в течение 4 ч при 37 °C (а в случае посевов замороженных продуктов или продуктов, которые хранились более 10 дней, - в течение 3 ч при температуре 32 °C и 2 ч при 37 °C). Далее температуру инкубации изменяют, и все посевы продолжают инкубировать в течение (22 +/- 2) ч при (42 +/- 1) °C.

Инкубация на всех этапах осуществляется в микроаэрофильных условиях в соответствии с ГОСТ ISO 10272-1.

Для ПЦР-анализа используют культуральную жидкость любой из вышеуказанных селективных сред.

6.3.7 Первичный посев пищевых продуктов для накопления бактерий L. monocytogenes проводят в бульон Фрейзера для предварительного селективного обогащения по 5.3.15. Подготовленную пробу массой 25 г (см³) вносят непосредственно в 225 см³ среды, предварительно прогретой в течение 15 мин при температуре 45 °C. Содержимое в колбе встряхивают круговыми движениями руки в радиусе 30 см. При необходимости анализа других масс (объемов) продукта их посев проводят в среду также в соотношении 1:9 по объему в соответствии с ГОСТ 32031.

Посевы термостатируют при (37 +/- 1) °C в течение (22 +/- 2) ч. В среде предобогащения, содержащей эскулин и цитрат железа аммонийного, отмечают почернение как признак возможного присутствия бактерий рода Listeria, способных к гидролизу гликозида эскулина до глюкозы и эскулетина. Эскулетин реагирует с ионами железа, образуя комплекс черного или оливкового цвета. На среде без эскулина почернения не наблюдается.

После инкубации продукта в среде для первичного обогащения независимо от наличия или отсутствия признаков роста, в том числе почернения, пересевают 1,0 см³ суспензии в 10 см³ бульона Фрейзера для вторичного селективного обогащения листерий по 5.3.15, предварительно нагретого до температуры 41 °C. Посевы термостатируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (22 +/- 2) ч.

Для ПЦР-анализа используют культуральную жидкость среды (бульона Фрейзера) для вторичного селективного обогащения листерий.

Допускается использовать культуральную жидкость среды (бульона Фрейзера) для первичного селективного обогащения листерий при наличии в нем признаков роста (почернение, помутнение) без проведения этапа вторичного обогащения.