ГОСТ 34232-2017. Межгосударственный стандарт. Мед. Методы определения активности сахаразы, диастазного числа, нерастворимых веществ

6. Метод определения активности сахаразы

 

6.1 Отбор и подготовка пробы

Пробу меда массой не менее 200 г отбирают по ГОСТ 19792.

Закристаллизованный мед размягчают в термостате или на водяной бане при температуре не выше 40 °C. Пробу охлаждают до комнатной температуры.

Мед с примесями процеживают при комнатной температуре через сито. Закристаллизованный мед продавливают через сито шпателем. Крупные механические частицы удаляют вручную.

Сотовый мед (без перговых ячеек) отделяют от сот при помощи сита без нагревания.

Пробу интенсивно и тщательно перемешивают не менее 3 мин. При этом следует обратить внимание на то, чтобы меньше воздуха попало в мед.

6.2 Сущность метода

Метод основан на фотометрическом определении количества продукта расщепления субстрата в условиях проведения ферментативной реакции и последующем вычислении активности сахаразы (-глюкозидазы, инвертазы) меда и инвертазного числа.

1 мкмоль субстрата, расщепленного сахаразой за 1 мин при оптимальных для ферментативной реакции условиях (значение pH, температура), соответствует 1 ед. активности.

Инвертазное число характеризует активность сахаразы меда.

Инвертазное число показывает массу сахаразы (в граммах), расщепленную содержащимися в 100 г меда ферментами за 1 ч при условиях испытания.

6.3 Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы

6.3.1 Спектрофотометр, снабженный светофильтром с максимумом пропускания при длине волны 400 нм и кюветами с четырьмя прозрачными стенками и длиной оптического пути 10 мм.

6.3.2 Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 высокого класса точности с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более +/- 0,1 мг.

6.3.3 Термометр ртутный стеклянный лабораторный с диапазоном значений от 0 °C до 100 °C и ценой деления шкалы 1 °C по ГОСТ 28498.

6.3.4 Термостат, водяная баня или другое устройство, позволяющее проводить равномерный нагрев до температуры 60 °C.

6.3.5 pH-метр/иономер с пределами допускаемой основной абсолютной погрешности прибора при преобразовании измеренного значения ЭДС в pX (pH) +/- 0,02 ед. pX (pH).

6.3.6 Сито из нержавеющей стали, диаметр отверстий 0,5 мм по ГОСТ ИСО 3310-1.

6.3.7 Секундомер механический с диапазоном измерений (0 - 60) с, (0 - 60) мин.

6.3.8 Шпатель лабораторный.

6.3.9 Палочки стеклянные лабораторные оплавленные длиной от 15 до 20 см.

6.3.10 Стаканы В-1-50 ТС по ГОСТ 25336.

6.3.11 Цилиндры мерные 1-500-2 по ГОСТ 1770.

6.3.12 Колбы мерные 1(2)-25(100,500,1000)-2(ПМ) по ГОСТ 1770.

6.3.13 Пипетки 1-2-1-1(5) по ГОСТ 29227.

6.3.14 Калий фосфорнокислый однозамещенный (KH₂PO₄) по ГОСТ 4198, х.ч.

6.3.15 Натрий фосфорнокислый двузамещенный (Na₂HPO₄) по ГОСТ 11773, х.ч.

6.3.16 (4-Nitrophenyl -D-glucopyranoside) с содержанием основного вещества не менее 98,0%.

6.3.17 Трис-(гидроксиметил)аминометан с содержанием основного вещества не менее 99,9%.

6.3.18 Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч.

6.3.19 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается использование других средств измерений, вспомогательного оборудования по метрологическим, техническим характеристикам не хуже указанных в настоящем стандарте.

Допускается использование других реактивов по качеству и чистоте не ниже вышеуказанных.

6.4 Подготовка к испытаниям

6.4.1 Приготовление буферного раствора (pH = 6,0)

Калий фосфорнокислый однозамещенный (KH₂PO₄) по 6.3.14 массой (11,66 +/- 0,01) г и натрий фосфорнокислый двузамещенный (Na₂HPO₄) по 6.3.15 массой (2,04 +/- 0,01) г растворяют в дистиллированной воде по 6.3.19 в мерной колбе по 6.3.12 вместимостью 1000 см³. Объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают. Измеряют и устанавливают pH, в случае его отклонения.

6.4.2 Приготовление раствора субстрата

по 6.3.16 массой (3,0126 +/- 0,0001) г растворяют в буферном растворе, приготовленном по 6.4.1, нагревая до температуры не выше (60 +/- 1) °C, в мерной колбе по 6.3.12 вместимостью 500 см³. Раствор быстро охлаждают до комнатной температуры и доводят до метки буферным раствором, перемешивают.

Раствор хранят в склянке из темного стекла при температуре 4 °C в течение 30 сут.

6.4.3 Приготовление раствора соляной кислоты концентрацией 3 моль/дм³

Соляную кислоту по 6.3.18 объемом 270 см³ осторожно приливают к 300 см³ дистиллированной воды по 6.3.19 в мерную колбу по 6.3.12 вместимостью 1000 см³, перемешивают. Объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают.

6.4.4 Приготовление фиксирующего раствора (pH = 9,5)

Трис-(гидроксиметил)аминометан по 6.3.17 массой (36,34 +/- 0,01) г растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 см³. Добавляют раствор соляной кислоты концентрацией 3 моль/дм³, приготовленный по 6.4.3, в объеме, достаточном для установления значения pH раствора (9,5 +/- 0,1) ед pH. Объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают.

6.4.5 Приготовление раствора меда

В стакан по 6.3.10 вместимостью 50 см³ взвешивают навеску меда, подготовленного по 6.1, массой (4,00 +/- 0,01) г. К навеске приливают 5 см³ буферного раствора, приготовленного по 6.4.1, мед тщательно растирают стеклянной палочкой по 6.3.9 и переносят жидкость в мерную колбу по 6.3.12 вместимостью 25 см³. Обработку пробы повторяют два-три раза до полного растворения меда, затем стакан несколько раз обмывают небольшими порциями буферного раствора по 6.4.1, которые также сливают в мерную колбу. Объем раствора в колбе доводят до метки буферным раствором, перемешивают.

Раствор хранят при температуре 4 °C в течение 24 ч.

6.5 Проведение испытаний

6.5.1 В две мерные колбы по 6.3.12 вместимостью 25 см³ вносят по 5 см³ раствора субстрата, приготовленного по 6.4.2. Колбы помещают в термостат или на водяную баню, с регулятором температуры, установленным на температуру (40,0 +/- 1,0) °C. Через 5 мин выдерживания при температуре (40,0 +/- 1,0) °C в первую колбу добавляют 0,5 см³ раствора меда, приготовленного по 6.4.5, и начинают отсчет времени по секундомеру по 6.3.7. Перемешивают содержимое колбы (рабочий раствор) в течение 10 с, вновь помещают колбу в термостат или на водяную баню температурой (40,0 +/- 1,0) °C. Через 20 мин в обе колбы добавляют по 0,5 см³ фиксирующего раствора, приготовленного по 6.4.4, смеси в колбах перемешивают в течение 10 с. Во вторую колбу добавляют 0,5 см³ раствора меда, приготовленного по 6.4.5, смесь (контрольный раствор) вновь перемешивают. Контрольный раствор готовят для каждого образца меда.

6.5.2 После охлаждения растворов до комнатной температуры измеряют оптическую плотность (D) рабочего раствора по отношению к контрольному раствору на спектрофотометре при длине волны в течение 60 мин. Оптическую плотность раствора определяют не менее трех раз.

Вычисляют среднеарифметическое значение оптической плотности рабочего раствора при условии, если абсолютное расхождение (D_макс - D_мин) результатов трех определений не превосходит значения . При невыполнении этого условия проводят повторные испытания. Вычисление проводят до третьего десятичного знака.

6.5.3 При анализе каждой пробы выполняют два параллельных определения.

6.6 Обработка и представление результатов испытаний

6.6.1 Значение активности сахаразы S, ед./кг меда, вычисляют по формуле

 

S = 794,7 D·m^-1, (1)

 

где 794,7 - коэффициент, учитывающий разбавление (в пересчете на 1 кг меда), объем рабочего раствора, пересчет времени реакции на 1 мин, молярную концентрацию продукта разложения субстрата;

D - оптическая плотность рабочего раствора по 6.5.2;

m - масса навески меда, г.

6.6.2 Значение инвертазного числа IN вычисляют по формуле

 

IN = 21,64D, (2)

 

где 21,64 - коэффициент линейной зависимости инвертазного числа от оптической плотности;

D - оптическая плотность рабочего раствора, найденная по 6.5.2.

6.6.3 За результаты испытаний принимают среднеарифметические значения двух параллельных определений активности сахаразы и инвертазного числа, полученных в условиях повторяемости, если абсолютные расхождения между параллельными определениями не превышают пределов повторяемости r по ГОСТ ИСО 5725-6. Значения пределов повторяемости r приведены в таблицах 1, 2.

 

Таблица 1

 

Диапазон измерений активности сахаразы S, ед./кг	Предел повторяемости r, при P = 0,95, ед./кг	Критический диапазон при трех измерениях CR0,95(3), ед./кг	Предел воспроизводимости R, при P = 0,95, ед./кг	Границы абсолютной погрешности , при P = 0,95, ед./кг
От 20,0 до 200,0 включ.

 

Таблица 2

 

Диапазон измерений инвертазного числа IN	Предел повторяемости r, при P = 0,95	Критический диапазон при трех измерениях CR0,95(3)	Предел воспроизводимости R, при P = 0,95	Границы абсолютной погрешности , при P = 0,95
От 2,2 до 21,8 включ.

 

При превышении пределов повторяемости r целесообразно провести дополнительные определения значений активности сахаразы и инвертазного числа и получить еще по одному результату. Если при этом абсолютные расхождения (S_макс - S_мин), (IN_макс - IN_мин) результатов трех определений не превышают значений критических диапазонов CR_0,95 (см. выше), то в качестве окончательных результатов принимают среднеарифметические значения результатов трех определений активности сахаразы и инвертазного числа. Значения критических диапазонов CR_0,95(3) приведены в таблицах 1, 2.

При невыполнении этого условия проводят повторные испытания.

6.6.4 Абсолютные расхождения между результатами испытаний активности сахаразы, инвертазного числа, полученными в двух лабораториях в условиях воспроизводимости, не должны превышать пределов воспроизводимости R по ГОСТ ИСО 5725-6. При выполнении этого условия приемлемы оба результата испытания каждого показателя и в качестве окончательного результата может быть использовано их среднеарифметическое значение. Значения пределов воспроизводимости R приведены в таблицах 1, 2.

6.6.5 Результаты испытаний, округленные до первого десятичного знака, в документах, предусматривающих их использование, представляют в виде:

 

, ед./кг, при P = 0,95, (3)

 

где - среднеарифметическое значение результатов определений активности сахаразы по 6.6.3, ед./кг;

- границы абсолютной погрешности результатов определений по 6.7, ед./кг.

 

, при P = 0,95, (4)

 

где - среднеарифметическое значение результатов определений инвертазного числа по 6.6.3;

- границы абсолютной погрешности результатов определений по 6.7.

6.7 Характеристика погрешности испытаний

Границы абсолютной погрешности результатов испытаний, получаемых согласно данному методу, , при доверительной вероятности P = 0,95, приведены в таблицах 1, 2.