ГОСТ 34232-2017. Межгосударственный стандарт. Мед. Методы определения активности сахаразы, диастазного числа, нерастворимых веществ
9. Метод определения диастазного числа по Фадебазу
9.1 Отбор и подготовка пробы - по 6.1.
9.2 Сущность метода
Метод основан на фотометрическом определении оптической плотности раствора меда, окрашенного в голубой цвет продуктами ферментативной реакции расщепления определенного количества субстрата (таблетки теста "Фадебаз" на амилазу), прямо пропорциональной активности диастазы меда, и последующем вычислении диастазного числа.
Единица диастазной активности определяется количеством ферментов, содержащихся в 1 г меда и расщепляющих 0,01 г крахмала за 1 ч при температуре 40 °C.
Диастазное число характеризует активность амилолитических ферментов меда.
9.3 Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы
9.3.1 Спектрофотометр или колориметр фотоэлектрический, снабженный светофильтром с максимумом пропускания при длине волны 620 нм и кюветами с четырьмя прозрачными стенками и длиной оптического пути 10 мм.
9.3.2 Весы по ГОСТ OIML R 76-1 среднего класса точности с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более +/- 0,01 г.
9.3.3 Термометр ртутный стеклянный лабораторный с диапазоном значений от 0 °C до 100 °C и ценой деления шкалы 1 °C по ГОСТ 28498.
9.3.4 Термостат, водяная баня или другое устройство, позволяющее проводить равномерный нагрев до температуры 40 °C.
9.3.5 pH-метр/иономер с пределами допускаемой основной абсолютной погрешности прибора при преобразовании измеренного значения ЭДС в pX (pH) +/- 0,02 ед. pX (pH).
9.3.6 Сито из нержавеющей стали, диаметр отверстий 0,5 мм по ГОСТ ИСО 3310-1.
9.3.7 Секундомер механический с диапазоном измерений (0 - 60) с, (0 - 60) мин.
9.3.8 Шпатель лабораторный.
9.3.9 Микросмеситель ППЭ-3 по НД с максимальной частотой вращения вала двигателя 2500 об/мин.
9.3.10 Палочки стеклянные лабораторные оплавленные длиной от 15 до 20 см.
9.3.11 Пинцет по ГОСТ 21241.
9.3.12 Фильтры обеззоленные, марка "синяя лента".
9.3.13 Воронки В-56-80 ХС по ГОСТ 25336.
9.3.14 Стаканы В-1-50 ТС по ГОСТ 25336.
9.3.15 Колбы мерные 1(2)-100(1000)-2(ПМ) по ГОСТ 1770.
9.3.16 Пробирки П2Т-10 ТС по ГОСТ 25336.
9.3.17 Пипетки 1-2-1-1(2,5,10) по ГОСТ 29227.
9.3.18 Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х.ч.
9.3.19 Натрий уксуснокислый 3-водный по ГОСТ 199, ч.д.а.
9.3.20 Кислота уксусная по ГОСТ 61, х.ч., ледяная.
9.3.21 Таблетки теста "Фадебаз" на амилазу с содержанием крахмала 45,0 мг.
9.3.22 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Допускается использование других средств измерений, вспомогательного оборудования по метрологическим, техническим характеристикам не хуже указанных в настоящем стандарте.
Допускается использование других реактивов по качеству и чистоте не ниже вышеуказанных.
9.4 Подготовка к испытаниям
9.4.1 Приготовление раствора гидроокиси натрия концентрацией 0,5 моль/дм3
Натрия гидроокись по 9.3.18 массой (20,00 +/- 0,01) г растворяют в дистиллированной воде по 9.3.22 в мерной колбе по 9.3.15 вместимостью 1000 см3. Объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают.
9.4.2 Приготовление ацетатного буферного раствора (pH = 5,2)
Натрий уксуснокислый 3-водный по 9.3.19 массой (13,60 +/- 0,01) г растворяют в дистиллированной воде по 9.3.22 в мерной колбе по 9.3.15 вместимостью 1000 см3. Добавляют 1 - 2 см3 ледяной уксусной кислоты по 9.3.20 для установления значения pH раствора (5,2 +/- 0,1) ед. pH. Объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают.
9.4.3 Приготовление раствора меда
В стакан по 9.3.14 вместимостью 50 см3 взвешивают навеску меда, подготовленного по 6.1, массой (1,00 +/- 0,01) г. К навеске приливают 10 см3 ацетатного буферного раствора, приготовленного по 9.4.2, мед тщательно растирают стеклянной палочкой по 9.3.10 и переносят жидкость в мерную колбу по 9.3.15 вместимостью 100 см3. Обработку пробы повторяют два-три раза до полного растворения меда, затем стакан несколько раз обмывают небольшими порциями буферного раствора, которые также сливают в мерную колбу. Объем раствора в колбе доводят до метки буферным раствором, перемешивают.
Раствор готовят в течение 1 ч непосредственно перед проведением испытания.
9.5 Проведение испытаний
9.5.1 В одну пробирку по 9.3.16 вместимостью 10 см3 помещают 5 см3 раствора меда, приготовленного по 9.4.3, в другую - 5 см3 ацетатного буферного раствора, приготовленного по 9.4.2. Пробирки помещают на водяную баню или в термостат по 9.3.4 при 40,0 °C (температуру контролируют термометром по 7.3.3). Через 15 мин выдерживания при температуре (40,0 +/- 1,0) °C в каждую из пробирок с помощью пинцета добавляют по одной таблетке теста "Фадебаз" на амилазу по 9.3.21 и начинают отсчет времени по таймеру. Содержимое пробирок перемешивают на микросмесителе по 9.3.9 в течение 10 с. Пробирки с растворами (испытуемым и контрольным) снова помещают в термостат или на водяную баню. Через 30 мин выдерживания при температуре (40,0 +/- 1,0) °C в каждую из пробирок добавляют по 1 см3 раствора гидроокиси натрия, приготовленного по 9.4.1, смеси тщательно перемешивают на микросмесителе по 9.3.9 в течение 5 с. Растворы быстро фильтруют через бумажный фильтр по 9.3.12 и измеряют оптическую плотность фильтратов испытуемого раствора (Dисп) и контрольного раствора (Dк) по отношению к дистиллированной воде на спектрофотометре по 9.3.1 при длине волны 
.
9.5.2 При анализе каждой пробы выполняют два параллельных определения.
9.6 Обработка результатов
9.6.1 Значение оптической плотности раствора пробы D вычисляют по формуле
D = Dисп - Dк, (10)
где Dисп - оптическая плотность испытуемого раствора;
Dк - соответствующая оптическая плотность контрольного раствора.
9.6.2 Если найденное по формуле (10) значение D > 1,0, то для приготовления раствора меда по 9.4.3 следует использовать мерную колбу вместимостью 200 см3. Отмечают фактор разбавления раствора меда (Q).
9.6.3 Значение диастазного числа X, ед. Шаде, вычисляют по формуле
X = 28,20 D·Q + 2,64, (11)
где 28,20 и 2,64 - коэффициенты линейной зависимости;
D - оптическая плотность пробы меда по 9.6.1;
Q - фактор разбавления раствора меда по 9.6.2.
9.6.4 За результат испытаний принимают среднеарифметическое значение двух параллельных определений диастазного числа, полученных в условиях повторяемости, если абсолютное расхождение между параллельными определениями не превышает предела повторяемости r по ГОСТ ИСО 5725-6. Значение предела повторяемости r приведено в таблице 6.
Таблица 6
Диапазон измерений диастазного числа X, ед. Шаде | Предел повторяемости r, при P = 0,95, ед. Шаде | Критический диапазон при трех измерениях CR0,95(3), ед. Шаде | Предел воспроизводимости R, при P = 0,95, ед. Шаде | Границы абсолютной погрешности |
От 0 до 40,0 включ. |
|
|
|
|
При превышении предела повторяемости r целесообразно провести дополнительное определение значения диастазного числа и получить еще один результат. Если при этом абсолютное расхождение (Xмакс - Xмин) результатов трех определений не превышает значения критического диапазона CR0,95(3), то в качестве окончательного результата принимают среднеарифметическое значение результатов трех определений диастазного числа. Значение критического диапазона CR0,95(3) приведено в таблице 6.
При невыполнении этого условия проводят повторные испытания.
9.6.5 Абсолютное расхождение между результатами испытаний диастазного числа, полученными в двух лабораториях в условиях воспроизводимости, не должно превышать предела воспроизводимости R по ГОСТ ИСО 5725-6. При выполнении этого условия приемлемы оба результата испытания, и в качестве окончательного результата может быть использовано их среднеарифметическое значение. Значение предела воспроизводимости R приведено в таблице 6.
9.6.6 Результат испытаний, округленный до первого десятичного знака, в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде
, ед. Шаде, при P = 0,95, (12)
где 
- среднеарифметическое значение результатов определений диастазного числа по 9.6.4, ед. Шаде;
- границы абсолютной погрешности результатов определений по 9.7, ед. Шаде.
9.7 Характеристика погрешности испытаний
Границы абсолютной погрешности результатов испытаний, получаемых согласно данному методу, , при доверительной вероятности P = 0,95, приведены в таблице 6.
Подписаться на обновления