ГОСТ 34232-2017. Межгосударственный стандарт. Мед. Методы определения активности сахаразы, диастазного числа, нерастворимых веществ
8. Метод определения диастазного числа по Шаде
8.1 Отбор и подготовка пробы - по 6.1.
8.2 Сущность метода
Метод основан на колориметрическом определении времени окончания ферментативной реакции расщепления заданного количества субстрата по достижении раствором оптической плотности, соответствующей активности диастазы меда, и последующем вычислении диастазного числа.
Единица диастазной активности определяется количеством ферментов, содержащихся в 1 г меда и расщепляющих 0,01 г крахмала за 1 ч при температуре 40 °C.
Диастазное число характеризует активность амилолитических ферментов меда.
8.3 Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы
8.3.1 Спектрофотометр или колориметр фотоэлектрический, снабженный светофильтром с максимумом пропускания при длине волны 660 нм и кюветами с четырьмя прозрачными стенками и длиной оптического пути 10 мм.
8.3.2 Весы по ГОСТ OIML R 76-1 высокого класса точности с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более +/- 0,0001 г.
8.3.3 Весы по ГОСТ OIML R 76-1 обычного класса точности с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более +/- 0,002 г.
8.3.4 Термометр ртутный стеклянный лабораторный с диапазоном значений от 0 °C до 100 °C и ценой деления шкалы 1 °C по ГОСТ 28498.
8.3.5 Термостат, водяная баня или другое устройство, позволяющее производить равномерный нагрев до температуры 40 °C.
8.3.6 pH-метр/иономер с пределами допускаемой основной абсолютной погрешности прибора при преобразовании измеренного значения ЭДС в pX (pH) +/- 0,02 ед. pX (pH).
8.3.7 Сито из нержавеющей стали, диаметр отверстий 0,5 мм по ГОСТ ИСО 3310-1.
8.3.8 Секундомер механический с диапазоном измерений (0 - 60) с, (0 - 60) мин.
8.3.9 Шпатель лабораторный.
8.3.10 Шкаф сушильный любого типа, обеспечивающий температуру нагрева до 250 °C с пределами абсолютной погрешности +/- 2 °C.
8.3.11 Электроплитка по ГОСТ 14919.
8.3.12 Палочки стеклянные лабораторные оплавленные длиной от 15 до 20 см.
8.3.13 Эксикатор по ГОСТ 25336.
8.3.14 Стаканы В-1-50 ТС по ГОСТ 25336.
8.3.15 Цилиндры мерные 1-100-2 по ГОСТ 1770.
8.3.16 Колбы мерные 1(2)-50(100,250,500)-2(ПМ) по ГОСТ 1770.
8.3.17 Колбы конические Кн-1(2,3)-25(50,250)-29/32(34) ТС по ГОСТ 25336.
8.3.18 Пробирки П-2-20-14/23 ХС по ГОСТ 1770.
8.3.19 Стаканчики для взвешивания СН-45/13(60/14) по ГОСТ 25336.
8.3.20 Пипетки 1-2-1-1(2,5,10,25) по ГОСТ 29227.
8.3.21 Натрий хлористый по ГОСТ 4233, х.ч.
8.3.22 Натрий уксуснокислый 3-водный по ГОСТ 199, ч.д.а.
8.3.23 Кислота уксусная по ГОСТ 61, х.ч. ледяная.
8.3.24 Крахмал растворимый по ГОСТ 10163, ч.д.а.
8.3.25 Йод по ГОСТ 4159, ч.д.а., дважды возогнанный.
8.3.26 Калий йодистый по ГОСТ 4232, х.ч.
8.3.27 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Допускается использование других средств измерений, вспомогательного оборудования по метрологическим, техническим характеристикам не хуже указанных в настоящем стандарте.
Допускается использование других реактивов по качеству и чистоте не ниже вышеуказанных.
8.4 Подготовка к испытаниям
8.4.1 Приготовление раствора хлористого натрия
Хлористый натрий по 8.3.21 массой (2,90 +/- 0,01) г растворяют в дистиллированной воде по 8.3.27 в мерной колбе по 8.3.16 вместимостью 100 см3. Объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают.
8.4.2 Приготовление ацетатного буферного раствора (pH = 5,3)
Натрий уксуснокислый 3-водный по 8.3.22 массой (43,50 +/- 0,01) г растворяют в дистиллированной воде по 8.3.27 в мерной колбе по 8.3.16 вместимостью 250 см3. Добавляют 5 см3 ледяной уксусной кислоты по 8.3.23 для установления значения раствора (5,3 +/- 0,1) ед. pH. Объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают.
8.4.3 Раствор крахмала
8.4.3.1 Высушивание крахмала
(3,0000 +/- 0,0001) г растворимого крахмала по 8.3.24 распределяют равномерным тонким слоем по дну бюксы по 8.3.19, предварительно высушенной, с крышкой, до постоянной массы при температуре (130 +/- 2) °C (результат взвешивания в граммах записывают с точностью до четвертого десятичного знака). Крахмал сушат при температуре (130 +/- 2) °C в течение 90 мин, охлаждают в эксикаторе по 8.3.13 и взвешивают (результат взвешивания в граммах записывают с точностью до четвертого десятичного знака). Высушивание повторяют по 30 мин до достижения постоянной массы.
Примечание - Для приготовления раствора необходимо использовать только растворимый крахмал, образующий при процедуре калибровки (см. 8.4.7) раствор с оптической плотностью в диапазоне от 0,745 до 0,770.
8.4.3.2 Приготовление раствора крахмала
Высушенный крахмал, подготовленный по 8.4.3.1, массой (2,000 +/- 0,001) г помещают в коническую колбу по 8.3.17 вместимостью 250 см3. Добавляют 90 см3 дистиллированной воды по 8.3.27, перемешивают. Содержимое колбы доводят до кипения и кипятят в течение 3 мин. Горячий раствор переносят в мерную колбу по 8.3.16 вместимостью 100 см3, быстро охлаждают под струей холодной воды до комнатной температуры. Объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают.
Раствор следует использовать в день приготовления.
8.4.4 Приготовление исходного раствора йода
Йод по 8.3.25, дважды возогнанный, массой (11,00 +/- 0,01) г и калий йодистый по 8.3.25 массой (22,00 +/- 0,01) г растворяют в 30 - 40 см3 дистиллированной воды по 8.3.27 в мерной колбе по 8.3.16 вместимостью 500 см3. Объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают.
Раствор хранят в склянке из темного стекла при комнатной температуре не более 12 мес.
8.4.5 Приготовление рабочего раствора йода
Калий йодистый по 8.3.26 массой (10,00 +/- 0,01) г растворяют в дистиллированной воде по 8.3.27 в мерной колбе по 8.3.16 вместимостью 250 см3. Добавляют 1 см3 исходного раствора йода, приготовленного по 8.4.4. Объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают.
Свежеприготовленный раствор следует использовать в течение 24 ч. Емкость после отбора необходимого количества раствора быстро и плотно закрывать, не допуская попадания воздуха.
8.4.6 Калибровка раствора крахмала
8.4.6.1 При калибровке устанавливается объем дистиллированной воды, при добавлении которого получившийся йодно-крахмальный раствор имеет оптическую плотность от 0,745 до 0,770.
8.4.6.2 Необходимый объем дистиллированной воды должен быть в диапазоне от 12 до 25 см3.
8.4.6.3 В четырнадцать конических колб по 8.3.17 вместимостью по 50 см3 помещают 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25 см3 дистиллированной воды по 8.3.27 и по 5 см3 рабочего раствора йода, приготовленного по 8.4.5. В первую колбу добавляют 0,5 см3 смеси, состоящей из 10 см3 воды и 5 см3 раствора крахмала, приготовленного по 8.4.3.2, хорошо встряхивают. Затем быстро измеряют оптическую плотность раствора по отношению к дистиллированной воде на спектрофотометре по 8.3.1 при длине волны 
.
Последовательно таким же образом поступают с остальными колбами до тех пор, пока не будет найден раствор с оптической плотностью от 0,745 до 0,770. Соответствующий объем дистиллированной воды следует считать стандартным для всех последующих испытаний, проводимых с раствором крахмала.
Примечание - Качество и чистота крахмала могут быть различными и зависят от партии и производителя. Объем дистиллированной воды следует устанавливать для каждой упаковки реактива. Время между добавлением рабочего раствора крахмала и определением оптической плотности должно быть по возможности одинаковым как при калибровке раствора крахмала, так и при проведении испытания пробы меда.
8.4.7 Приготовление раствора меда
(10,00 +/- 0,01) г меда, подготовленного по 6.1, растворяют в 15 см3 дистиллированной воды и 5 см3 ацетатного буферного раствора, приготовленного по 8.4.2, в стакане по 8.3.14 вместимостью 50 см3. Раствор количественно переносят в мерную колбу по 8.3.16 вместимостью 50 см3, добавляют 3 см3 раствора хлористого натрия, приготовленного по 8.4.1. Объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают.
Раствор готовят непосредственно перед проведением испытания.
8.5 Проведение испытаний
8.5.1 Испытание раствора пробы
8.5.1.1 В пробирку по 8.3.18 вместимостью 20 см3 помещают 10 см3 раствора меда, приготовленного по 8.4.7, в другую пробирку - 10 см3 раствора крахмала, приготовленного по 8.4.3.2. Обе пробирки закрывают пробками и помещают в термостат или на водяную баню по 8.3.5 при 40,0 °C (температуру контролируют термометром по 7.3.3). Через 15 мин выдерживания при температуре (40 +/- 1,0) °C из второй пробирки отбирают 5 см3 раствора крахмала и переносят в первую пробирку с раствором меда. Реакционную смесь перемешивают и начинают отсчет времени по 8.3.8.
8.5.1.2 Через периодические промежутки времени 
(первый раз через 5 мин) из пробирки отбирают по 0,5 см3 реакционной смеси, приготовленной по 8.5.1.1, и быстро добавляют к 5 см3 рабочего раствора йода, приготовленного по 8.4.5, в коническую колбу по 8.3.17 вместимостью 50 см3. Добавляют дистиллированную воду объемом, установленным по 8.4.6.3, перемешивают.
8.5.1.3 Затем быстро измеряют оптическую плотность каждого раствора по 8.5.1.2 (Dt) по отношению к дистиллированной воде на спектрофотометре при длине волны .
8.5.1.4 Если измеренное значение оптической плотности раствора ниже 0,350, то проведение испытания начинают снова по 8.5.1 с новой порцией раствора меда, сократив время первого промежутка времени выдерживания.
8.5.1.5 Периодические промежутки времени после первого отбора реакционной смеси следует отмерять таким образом, чтобы три-четыре измеренных значения оптической плотности растворов укладывались в диапазон значений от 0,155 до 0,456. Примерные рекомендуемые значения промежутков времени между отборами реакционной смеси приведены в таблице 4.
Таблица 4
Значение оптической плотности раствора Dисп | Следующий промежуток времени |
От 0,456 до 0,523 включ. | От 2 до 5 |
Св. 0,523 до 0,658 включ. | От 5 до 10 |
Св. 0,658 | 10 и более |
8.5.2 Испытание контрольного раствора
Определяют значение оптической плотности контрольного раствора (Dк) по 8.5.1, заменив объем раствора крахмала на соответствующий объем дистиллированной воды.
8.5.3 При анализе каждой пробы выполняют два параллельных определения.
8.6 Обработка результатов
8.6.1 Значение оптической плотности каждого раствора D вычисляют по формуле
D = Dисп - Dк, (7)
где Dисп - оптическая плотность испытуемого раствора;
Dк - соответствующая оптическая плотность контрольного раствора.
8.6.2 Строят градуировочный график, откладывая на оси ординат значение оптической плотности каждого раствора (D), а на оси абсцисс - соответствующее этому значению время реакции (t) в минутах. Градуировочный график должен быть линейным в заданном диапазоне.
8.6.3 Для каждой пробы по градуировочному графику находят значение времени реакции (tx), соответствующее значению оптической плотности D = 0,301.
Примечание - Для определения времени реакции (tx) по методу Шаде используется оптическая плотность D = 0,235.
8.6.4 Значение диастазного числа X, ед. Шаде, вычисляют по формуле
, (8)
где 300 - коэффициент пересчета;
tx - время реакции, найденное по 8.6.3, мин.
8.6.5 За результат испытаний принимают среднеарифметическое значение двух параллельных определений диастазного числа, полученных в условиях повторяемости, если абсолютное расхождение между параллельными определениями не превышает предела повторяемости r по ГОСТ ИСО 5725-6. Значение предела повторяемости r приведено в таблице 5.
Таблица 5
Диапазон измерений диастазного числа X, ед. Шаде | Предел повторяемости r, при P = 0,95, ед. Шаде | Критический диапазон при трех измерениях CR0,95(3), ед. Шаде | Предел воспроизводимости R, при P = 0,95, ед. Шаде | Границы абсолютной погрешности |
От 0 до 40,0 включ. |
|
|
|
|
При превышении предела повторяемости r целесообразно провести дополнительное определение значения диастазного числа и получить еще один результат. Если при этом абсолютное расхождение (Xмакс - Xмин) результатов трех определений не превышает значения критического диапазона CR0,95(3), то в качестве окончательного результата принимают среднеарифметическое значение результатов трех определений диастазного числа. Значение критического диапазона CR0,95(3) приведено в таблице 5.
При невыполнении этого условия проводят повторные испытания.
8.6.6 Абсолютное расхождение между результатами испытаний диастазного числа, полученными в двух лабораториях в условиях воспроизводимости, не должно превышать предела воспроизводимости R по ГОСТ ИСО 5725-6. При выполнении этого условия приемлемы оба результата испытания и в качестве окончательного результата может быть использовано их среднеарифметическое значение. Значение предела воспроизводимости R приведено в таблице 5.
8.6.7 Результат испытаний, округленный до первого десятичного знака, в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде
, ед. Шаде, при P = 0,95, (9)
где 
- среднеарифметическое значение результатов определений диастазного числа по 8.6.5, ед. Шаде;
- границы абсолютной погрешности результатов определений по 8.7, ед. Шаде.
8.7 Характеристика погрешности испытаний
Границы абсолютной погрешности результатов испытаний, получаемых согласно данному методу, , при доверительной вероятности P = 0,95, приведены в таблице 5.
Подписаться на обновления