ГОСТ 34232-2017. Межгосударственный стандарт. Мед. Методы определения активности сахаразы, диастазного числа, нерастворимых веществ

7. Метод определения диастазного числа

 

7.1 Отбор и подготовка пробы - по 6.1.

7.2 Сущность метода

Метод основан на колориметрическом определении количества субстрата, расщепленного в условиях проведения ферментативной реакции, и последующем вычислении диастазного числа.

Диастазное число характеризует активность амилолитических ферментов меда.

Диастазное число выражают количеством кубических сантиметров раствора крахмала массовой долей 1%, которое разлагается за 1 ч амилолитическими ферментами, содержащимися в 1 г безводного вещества меда.

1 см³ раствора крахмала массовой долей 1% соответствует 1 ед. активности Готе.

7.3 Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы

7.3.1 Колориметр фотоэлектрический, снабженный светофильтром с максимумом пропускания при длине волны 590 нм и кюветами с четырьмя прозрачными стенками и длиной оптического пути 10 мм.

7.3.2 Весы по ГОСТ OIML R 76-1 высокого класса точности с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более +/- 0,1 мг.

7.3.3 Термометр ртутный стеклянный лабораторный с диапазоном значений от 0 °C до 100 °C и ценой деления шкалы 1 °C по ГОСТ 28498.

7.3.4 Термостат, водяная баня или другое устройство, позволяющее проводить равномерный нагрев до температуры 40 °C.

7.3.5 pH-метр/иономер с пределами допускаемой основной абсолютной погрешности прибора при преобразовании измеренного значения ЭДС в pX (pH) +/- 0,02 ед. pX (pH).

7.3.6 Сито из нержавеющей стали, диаметр отверстий 0,5 мм по ГОСТ ИСО 3310-1.

7.3.7 Секундомер механический с диапазоном измерений (0 - 60) с, (0 - 60) мин.

7.3.8 Шпатель лабораторный.

7.3.9 Палочки стеклянные лабораторные оплавленные длиной от 15 до 20 см.

7.3.10 Стаканы В-1-50 ТС по ГОСТ 25336.

7.3.11 Цилиндры мерные 1-50(100)-2 по ГОСТ 1770.

7.3.12 Колбы мерные 1(2)-50(100,250)-2(ПМ) по ГОСТ 1770.

7.3.13 Колбы конические Кн-1(2,3)-250-29/32(34) ТС по ГОСТ 25336.

7.3.14 Пробирки П-2-20-14/23 ХС по ГОСТ 1770.

7.3.15 Пипетки 1-2-1-1 по ГОСТ 29227.

7.3.16 Бюретки 1-2-25(50)-0,1 по ГОСТ 29251.

7.3.17 Натрий хлористый по ГОСТ 4233, ч.д.а., раствор концентрацией 0,1 моль/дм³.

7.3.18 Натрий уксуснокислый 3-водный по ГОСТ 199, х.ч.

7.3.19 Кислота уксусная по ГОСТ 61, х.ч., ледяная.

7.3.20 Крахмал растворимый по ГОСТ 10163, ч.д.а.

7.3.21 Йод по ГОСТ 4159, ч.д.а., раствор концентрацией 0,015 моль/дм³.

7.3.22 2,4-Динитрофенол, ч.д.а.

7.3.23 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается использование других средств измерений, вспомогательного оборудования по метрологическим, техническим характеристикам не хуже указанных в настоящем стандарте.

Допускается использование других реактивов по качеству и чистоте не ниже вышеуказанных.

7.4 Подготовка к испытаниям

7.4.1 Приготовление ацетатного буферного раствора концентрацией 0,2 моль/дм³ (pH = 5,0)

7.4.1.1 Готовят 100 см³ раствора уксусной кислоты по 7.3.19 с концентрацией 0,2 моль/дм³ в соответствии с ГОСТ 4919.2.

7.4.1.2 Готовят 300 см³ раствора уксуснокислого натрия по 7.3.18 с концентрацией 0,2 моль/дм³ в соответствии с ГОСТ 4919.2.

7.4.1.3 Смешивают растворы уксусной кислоты по 7.4.1.1 и уксуснокислого натрия по 7.4.1.2. С помощью pH-метра по 7.3.5 устанавливают значение полученного раствора (5,0 +/- 0,1) ед. pH, добавляя раствор уксусной кислоты или уксуснокислого натрия.

7.4.1.4 (0,350 +/- 0,001) г 2,4-динитрофенола по 7.3.22 растворяют в 10 - 20 см³ буферного раствора, приготовленного по 7.4.1.3, нагревая до температуры не выше (40 +/- 1) °C, в стакане по 7.3.10 вместимостью 50 см³. Раствор количественно переносят в мерную колбу по 7.3.12 вместимостью 250 см³. Объем раствора в колбе доводят до метки буферным раствором, перемешивают.

7.4.2 Приготовление раствора крахмала

(0,250 +/- 0,001) г крахмала по 7.3.20 растворяют в 10 - 15 см³ дистиллированной воды по 7.3.23 в стакане по 7.3.10 вместимостью 50 см³. Раствор осторожно количественно переносят в коническую колбу по 7.3.13 вместимостью 250 см³ с 50 см³ кипящей дистиллированной воды. Кипячение смеси продолжают в течение 2 - 3 мин. Колбу охлаждают до температуры (20 +/- 1) °C. Содержимое количественно переносят в мерную колбу по 7.3.12 вместимостью 100 см³. Объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают.

7.4.3 Приготовление комбинированного реактива

Смешивают восемь объемных частей раствора крахмала, приготовленного по 7.4.2, пять объемных частей ацетатного буферного раствора, приготовленного по 7.4.1, и одну объемную часть раствора хлористого натрия по 7.3.17. Полученную смесь тщательно перемешивают.

Реактив хранят при комнатной температуре не более 3 мес.

7.4.4 Приготовление раствора меда

(5,00 +/- 0,01) г меда, подготовленного по 6.1, растворяют в 15 - 20 см³ дистиллированной воды по 7.3.23 в стакане по 7.3.10 вместимостью 50 см³. Раствор количественно переносят в мерную колбу по 7.3.12 вместимостью 50 см³. Объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают.

Раствор готовят непосредственно перед проведением испытания.

7.4.5 Определение массовой доли воды в меде

Определение массовой доли воды в меде, подготовленном по 6.1, проводят по ГОСТ 31774.

7.5 Проведение испытаний

7.5.1 В две пробирки по 7.3.14 отмеряют из бюретки по 7.3.16 по 14 см³ комбинированного реактива, приготовленного по 7.4.3. Пробирки закрывают пробками и помещают на водяную баню по 7.3.4 при 40,0 °C (температуру контролируют термометром по 7.3.3). Через 10 мин выдерживания при температуре (40,0 +/- 1,0) °C, не доставая пробирки из бани, в первую вносят пипеткой 1,0 см³ раствора меда, приготовленного по 7.4.4, во вторую - 1,0 см³ дистиллированной воды, одновременно включая секундомер. Содержимое пробирок перемешивают и вновь помещают на водяную баню. Каждую пробирку выдерживают на водяной бане при температуре (40,0 +/- 1,0) °C в течение 15 мин.

7.5.2 В две мерные колбы по 7.3.12 вместимостью 50 см³ помещают по 40 см³ дистиллированной воды по 7.3.23 и по 1 см³ свежеприготовленного раствора йода по 7.3.21, перемешивают и выдерживают на водяной бане при температуре (20,0 +/- 1,0) °C.

7.5.3 Через 15 мин, не доставая пробирок из водяной бани, быстро отбирают из каждой по 2,0 см³ реакционных смесей и вносят их при перемешивании в мерные колбы с раствором йода по 7.5.2. Объемы растворов в колбах доводят до метки дистиллированной водой. Колбы закрывают пробками, содержимое тщательно перемешивают и выдерживают на водяной бане при температуре (20,0 +/- 1,0) °C ровно в течение 10 мин.

7.5.4 Затем быстро измеряют оптическую плотность испытуемого (D_исп) и контрольного (D_к) растворов по отношению к дистиллированной воде на фотоэлектроколориметре при длине волны 590 нм.

7.5.5 При анализе каждой пробы выполняют два параллельных определения.

7.6 Обработка и представление результатов испытаний

7.6.1 Значение диастазного числа меда X, ед. Готе, в пересчете на 1 г безводного вещества, вычисляют по формуле

 

, (5)

 

где 80 - коэффициент пересчета;

D_к - оптическая плотность контрольного раствора;

D_исп - соответствующая оптическая плотность испытуемого раствора;

W - массовая доля воды в меде, найденная по 7.4.5, %.

7.6.2 За результат испытаний принимают среднеарифметическое значение двух параллельных определений диастазного числа, полученных в условиях повторяемости, если абсолютное расхождение между параллельными определениями не превышает предела повторяемости r по ГОСТ ИСО 5725-6. Значение предела повторяемости r приведено в таблице 3.

 

Таблица 3

 

Диапазон измерений диастазного числа X, ед. Готе	Предел повторяемости r, при P = 0,95, ед. Готе	Критический диапазон при трех измерениях CR0,95(3), ед. Готе	Предел воспроизводимости R, при P = 0,95, ед. Готе	Границы абсолютной погрешности , при P = 0,95, ед. Готе
От 3,0 до 20,0 включ.
Св. 20,0 до 40,0 включ.

 

При превышении предела повторяемости r целесообразно провести дополнительное определение значения диастазного числа и получить еще один результат. Если при этом абсолютное расхождение (X_макс - X_мин) результатов трех определений не превышает значения критического диапазона CR_0,95(3), то в качестве окончательного результата принимают среднеарифметическое значение результатов трех определений диастазного числа. Значение критического диапазона CR_0,95(3) приведено в таблице 3.

При невыполнении этого условия проводят повторные испытания.

7.6.3 Абсолютное расхождение между результатами испытаний диастазного числа, полученными в двух лабораториях в условиях воспроизводимости, не должно превышать предела воспроизводимости R по ГОСТ ИСО 5725-6. При выполнении этого условия приемлемы оба результата испытания и в качестве окончательного результата может быть использовано их среднеарифметическое значение. Значение предела воспроизводимости R приведено в таблице 3.

7.6.4 Результат испытаний, округленный до первого десятичного знака, в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде

 

, ед. Готе, при P = 0,95, (6)

 

где - среднеарифметическое значение результатов определений диастазного числа по 7.6.2, ед. Готе;

- границы абсолютной погрешности результатов определений по 7.7, ед. Готе.

7.7 Характеристика погрешности испытаний

Границы абсолютной погрешности результатов испытаний, получаемых согласно данному методу, , при доверительной вероятности P = 0,95, приведены в таблице 3.