ГОСТ 34108-2017. Межгосударственный стандарт. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Определение содержания микотоксинов прямым твердофазным конкурентным иммуноферментным методом
12 Проведение испытания
12.1 Приготовление экстрактов микотоксинов
Взвешивают анализируемую пробу массой около 20 г, с записью результата до второго десятичного знака, помещают в коническую колбу вместимостью 250 см3, добавляют 100 см3 экстрагента (см. таблицу 1). Закрывают пробкой и перемешивают в течение 30 мин на устройстве для смешивания. Полученный раствор фильтруют через бумажный складчатый фильтр.
Примечания:
1 При экстракции необходимо соблюдать соотношение массы анализируемой пробы к объему растворителя 1:5.
2 Допускается использование ультразвуковой обработки (мощность генератора 35 Вт, рабочая частота 22 кГц) в ультразвуковой бане в течение 30 мин или проведение экстракции в блендере в течение 3 мин с высокой скоростью.
3 Экстракт должен иметь значение pH в интервале 6 - 8 единиц pH. Излишняя щелочность или кислотность экстракта может повлиять на результаты анализа, поэтому ее необходимо корректировать. Увеличить значение pH раствора можно добавлением в него 1 М раствора гидроокиси калия (KOH), уменьшить значение pH можно добавлением 1 М растворов азотной кислоты (HNO3), серной кислоты (H2SO4) или ортофосфорной кислоты (H3PO4).
Таблица 1
Наименование микотоксина | Экстрагент | Коэффициент разбавления, f1 |
Афлатоксин B1 | Раствор А (см. 11.4.1) | 2 |
Сумма афлатоксинов | Раствор А (см. 11.4.1) | 1 |
ДОН | Дистиллированная вода | 4 |
Зеараленон | Раствор А (см. 11.4.1) | 5 |
Охратоксин A | Раствор А (см. 11.4.1) | 1 |
T-2 токсин | Раствор А (см. 11.4.1) | 1 |
Сумма фумонизинов | Раствор А (см. 11.4.1) | 20 |
Фильтрат для определения содержания суммы афлатоксинов, охратоксина A, T-2 токсина используют для дальнейшего проведения испытания по 12.2.
Фильтрат для определения содержания афлатоксина B1 разбавляют буферным раствором в соответствии с таблицей 1 и далее используют для дальнейшего проведения испытания по 12.2. Разбавление экстракта для определения содержания афлатоксина B1 проводят следующим образом: в виалу дозатором помещают 1 см3 буферного раствора, вносят 1 см3 фильтрата, перемешивают.
Фильтрат для определения содержания ДОН, зеараленона, суммы фумонизинов разбавляют экстрагентом в соответствии с таблицей 1 и далее используют для дальнейшего проведения испытания по 12.2.
Разбавление экстракта для определения содержания ДОН проводят следующим образом: в виалу дозатором помещают 3 см3 дистиллированной воды, вносят 1 см3 фильтрата, перемешивают.
Разбавление экстракта для определения содержания зеараленона проводят следующим образом: в виалу дозатором помещают 4 см3 раствора А, вносят 1 см3 фильтрата, перемешивают.
Разбавление экстракта для определения содержания суммы фумонизинов проводят следующим образом: в виалу дозатором помещают 1,9 см3 дистиллированной воды, вносят 0,1 см3 фильтрата, перемешивают.
12.2 Проведение градуировки и анализа экстрактов проб
Анализ градуировочных растворов и экстрактов проб проводят одновременно. В рамку первого планшета помещают необходимое количество стрипов зеленого (голубого) цвета для смешивания реактивов. В рамку второго планшета помещают такое же количество бесцветных стрипов с иммобилизованными АТ.
Примечание - Допускается помещать стрипы для смешивания реактивов и стрипы с иммобилизованными АТ в один планшет, при этом после смешивания реактивов и переноса растворов стрипы для смешивания удаляют из планшета.
Отмеряют необходимое количество раствора конъюгата из комплекта реактивов к тест-системе (примерно 240 мм3 на лунку или 2 см3 на стрип) и помещают в отдельную емкость (или в специальную кювету при использовании восьмиканального пипеточного дозатора). Используя восьмиканальный дозатор, осторожно, не касаясь лунок, вносят по 200 мм3 раствора конъюгата в каждую лунку стрипов зеленого (голубого) цвета первого планшета. В остальные лунки первого планшета одноканальным дозатором вносят по 100 мм3 каждого градуировочного раствора или экстракта пробы, используя для каждого раствора новый наконечник.
Примечание - Допускается уменьшать объем растворов, но при этом отношение объема конъюгата к объему экстракта (градуировочного раствора) должно быть 2:1. Объем жидкости, переносимый из лунок для смешивания в лунки с антителами, должен быть одинаковым (100 мм3).
Восьмиканальным дозатором с новыми наконечниками трижды смешивают содержимое лунок пипетированием (набирают и выпускают раствор) и быстро переносят по 100 мм3 содержимого каждой лунки стрипа зеленого (голубого) цвета в соответствующую ей лунку бесцветного стрипа второго планшета. Инкубируют в течение времени, указанного в таблице 2.
Примечание - Необходимо избегать встряхивания планшета с антителами, поскольку это может привести к разрушению сцепки между антигеном и антителом или к смешиванию содержимого разных лунок.
Таблица 2
Наименование микотоксина | Разбавляющий раствор | Время инкубации с раствором конъюгата, мин | Время инкубации с раствором субстрата, мин | Промывочный раствор | Длина волны, нм |
Афлатоксин B1 | Раствор А (см. 12.4.1) | 10 | 10 | Дистиллированная вода | 450 <*> |
Сумма афлатоксинов | Раствор А (см. 12.4.1) | 15 | 5 | Дистиллированная вода | 450 |
ДОН | Дистиллированная вода | 15 | 5 | Промывочный раствор по 12.4.2 | 450 |
Зеараленон | Раствор А (см. 12.4.1) | 10 | 10 | Дистиллированная вода | 450 <*> |
Охратоксин A | Раствор А (см. 12.4.1) | 10 | 5 | Дистиллированная вода | 450 <*> |
T-2 токсин | Раствор А (см. 12.4.1) | 10 | 5 | Дистиллированная вода | 450 <*> |
Сумма фумонизинов | Раствор А (см. 12.4.1) | 10 | 5 | Дистиллированная вода | 450 |
<*> Допускается использование дифференциального фильтра на 630 нм | |||||
Удаляют содержимое микролунок, промывают лунки промывочным раствором (см. таблицу 2). Процедуру промывки планшета рекомендуется проводить с помощью устройства для отмывки планшетов, задавая следующие параметры программы: количество циклов промывки - от трех до четырех, объем заливаемого промывочного раствора - 300 мм3. Допускается ручная промывка с использованием многоканального дозатора. При этом в лунки планшета вносят 4 раза по 300 мм3 промывочного раствора с последующим резким переворачиванием и встряхиванием планшета.
Планшет переворачивают лунками вниз на фильтровальную бумагу и окончательно удаляют из лунок остатки промывочного раствора легким постукиванием.
Отмеряют необходимое количество раствора субстрата из комплекта реактивов к тест-системе (примерно 120 мм3 на лунку или 1 см3 на стрип) и помещают в отдельную емкость. Используя восьмиканальный дозатор, вносят по 100 мм3 раствора субстрата в каждую лунку. Инкубируют в течение времени, указанного в таблице 2.
Отмеряют необходимое количество останавливающего раствора из комплекта реактивов к тест-системе (примерно 120 мм3 на лунку или 1 см3 на стрип) и помещают в отдельную емкость. Используя восьмиканальный дозатор, вносят по 100 мм3 останавливающего раствора в каждую лунку. Цвет раствора изменяется с голубого на желтый.
Измеряют оптическую плотность D содержимого лунок при длине волны, указанной в таблице 2. Значения оптической плотности записывают с точностью до второго десятичного знака и заносят в форму для записи (см. приложение В).
Примечание - Перед фотометрией нужно избавиться от воздушных пузырьков в лунке, поскольку они могут повлиять на результат анализа.
12.3 Построение и оценка градуировочной характеристики
На основании полученных значений оптической плотности с помощью специального программного обеспечения рассчитывают массовую концентрацию микотоксина в экстракте пробы.
Примечание - Если в инструкции к тест-системе концентрация градуировочных растворов микотоксинов пересчитана на массу навески с учетом всех разведений, то программа рассчитывает содержание микотоксина в анализируемой пробе. В этом случае в приведенных ниже расчетах вместо массовой концентрации микотоксина в градуировочном растворе используют содержание микотоксина.
При отсутствии специального программного обеспечения построение градуировочного графика проводят с помощью программы Excel.
Вычисляют логарифм массовой концентрации (содержание) микотоксина LgCгр каждого градуировочного раствора. Полученные значения являются координатами точек градуировочной характеристики по оси X.
Определяют процент связывания микотоксина для каждого градуировочного раствора относительно нулевой точки по формуле
, (1)
где Dгр - измеренное значение оптической плотности для i-го градуировочного раствора;
D0 - измеренное значение оптической плотности для нулевой точки;
100 - коэффициент перевода в проценты.
Для каждого градуировочного раствора определяют
, (2)
где Dгр - измеренное значение оптической плотности для i-го градуировочного раствора;
D0 - измеренное значение оптической плотности для нулевой точки.
Полученные значения являются координатами точек градуировочной характеристики по оси Y.
По значениям Xi и Yi строят градуировочную характеристику, пример которой представлен на рисунке 1.
Рисунок 1 - Пример градуировочной характеристики
Полученная градуировочная характеристика описывается уравнением
, (3)
где Di - измеренное значение оптической плотности для i-го раствора;
D0 - измеренное значение оптической плотности для нулевой точки;
Ci - массовая концентрация (содержание) микотоксина i-го раствора, мг/дм3 (мг/кг);
a, b - коэффициенты линейного уравнения.
Для контроля градуировочной характеристики используют i-й градуировочный раствор. По градуировочной характеристике вычисляют массовую концентрацию (содержание) Ci, изм микотоксина в i-м градуировочном растворе, мг/дм3 (мг/кг)
(4)
где Di - измеренное значение оптической плотности для i-го раствора;
D0 - измеренное значение оптической плотности для нулевой точки;
Ci - массовая концентрация (содержание) микотоксина i-го раствора, мг/дм3 (мг/кг);
a, b - коэффициенты линейного уравнения.
Градуировочную характеристику признают стабильной, если выполняется условие
, (5)
где Ci, изм - массовая концентрация (содержание) микотоксина в i-м градуировочном растворе, вычисленная по формуле (4), мг/дм3 (мг/кг);
Ci - массовая концентрация (содержание) микотоксина в i-м градуировочном растворе, мг/дм3 (мг/кг);
g1 - норматив контроля при доверительной вероятности P = 0,95 (см. таблицу 3).
Таблица 3
В процентах
Наименование микотоксина | Норматив контроля | |
g1 | g2 | |
Афлатоксин B1 | 10 | - |
Сумма афлатоксинов | 10 | - |
ДОН | 12 | - |
Зеараленон | 10 | - |
Охратоксин A | 18 | 97 |
T-2 токсин | 11 | - |
Сумма фумонизинов | 10 | 95 |
Подписаться на обновления