ГОСТ 25011-2017. Межгосударственный стандарт. Мясо и мясные продукты. Методы определения белка

6. Определение массовой доли белка по методу Кьельдаля

 

6.1 Сущность метода

Метод основан на минерализации органических веществ пробы с последующим определением азота по количеству образовавшегося аммиака.

6.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы и реактивы

Мясорубка механическая по ГОСТ 4025 или электрическая по ГОСТ 20469 с решеткой, диаметр отверстий которой не более 4,5 мм, или гомогенизатор.

Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 специального или высокого класса точности с пределом допускаемой абсолютной погрешности не более +/- 0,001 г.

Холодильник по ГОСТ 26678.

Часы электронно-механические кварцевые наручные и карманные по ГОСТ 26272.

Аппарат для перегонки с водяным паром (Парнаса-Вагнера) или обыкновенная установка для перегонки.

Установка электрическая или газовая для сжигания с регулируемой интенсивностью обогревания, позволяющая обогревать колбы Кьельдаля в наклонном положении таким образом, чтобы зона нагрева находилась ниже уровня жидкости в колбе. Установка должна быть оснащена вытяжным устройством, позволяющим удалять испарения кислот во время обогревания.

Титратор автоматический потенциометрический.

Колбы Кьельдаля 1-50-14/23 ТС или 1-100-14/23 ТС, 2-50-14 ТХС или 2-100-14 ТХС по ГОСТ 25336.

Колбы мерные 1-1000-2 или 2-1000-2, 1-2000-2 или 2-2000-2 по ГОСТ 1770.

Бюретка 1-2-50-0,1 или 2-2-50-0,1 по ГОСТ 29251.

Банка стеклянная вместимостью 200 - 400 см³ с крышкой.

Колбы Кн-1-500-29/32 или Кн-2-500-34 по ГОСТ 25336.

Цилиндры 1-25, 1-50, 1-100, 1-500 по ГОСТ 1770.

Стаканы В-1-600 ТХС или Н-1-600 ТХС по ГОСТ 25336.

Капельница по ГОСТ 25336.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

Бусы карборундовые.

Куски пемзы свежевыжженные.

Масло парафиновое чистое.

Бумага универсальная индикаторная или бумага лакмусовая.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или вода для лабораторного анализа по ГОСТ ISO 3696, степень чистоты 1.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч.

Кислота борная по ГОСТ 9656, х.ч.

Кислота серная по ГОСТ 4204, х.ч.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х.ч.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.

Аммоний сернокислый по ГОСТ 3769, х.ч.

Калий сернокислый по ГОСТ 4145, х.ч.

Медь (II) сернокислая 5-водная по ГОСТ 4165, х.ч.

Метиловый красный, х.ч.

Метиленовый голубой, х.ч.

Стандарт-титр (фиксанал) для приготовления раствора соляной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм³.

Стандарт-титр (фиксанал) для приготовления раствора серной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм³.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, вспомогательного оборудования с техническими характеристиками не ниже, а также материалов и реактивов по качеству не ниже указанных в настоящем стандарте.

6.3 Подготовка к анализу

6.3.1 Приготовление раствора гидроокиси натрия массовой концентрации 330 г/дм³

Растворяют 330 г гидроокиси натрия в 200 - 300 см³ дистиллированной воды, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см³ и доводят объем дистиллированной водой до метки. Раствор хранят при температуре (20 +/- 2) °C не более 1 мес.

6.3.2 Приготовление раствора борной кислоты массовой концентрации 40 г/дм³

Растворяют 40 г борной кислоты в 200 - 300 см³ дистиллированной воды, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см³ и доводят объем дистиллированной водой до метки. Раствор хранят при температуре (20 +/- 2) °C не более 1 мес.

6.3.3 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации c (HCl) = 0,1 моль/дм³

6.3.3.1 Раствор соляной кислоты молярной концентрации c (HCl) = 0,1 моль/дм³ готовят по ГОСТ 25794.1 (пункт 2.1.2).

Примечание - Допускается приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм³ из стандарт-титра (фиксанала) в соответствии с прилагаемой инструкцией.

 

6.3.3.2 Определение коэффициента поправки к номинальной концентрации раствора соляной кислоты c (HCl) = 0,1 моль/дм³ проводят по ГОСТ 25794.1 (пункт 2.1.3).

6.3.4 Приготовление раствора серной кислоты молярной концентрации c (H₂SO₄) = 0,05 моль/дм³

6.3.4.1 Раствор серной кислоты молярной концентрации c (H₂SO₄) = 0,1 моль/дм³ готовят по ГОСТ 25794.1 (пункт 2.1.2), а затем количественно переносят в мерную колбу вместимостью 2000 см³ и доводят дистиллированной водой до метки.

Примечание - Допускается приготовление раствора серной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм³ из стандарт-титра (фиксанала) в соответствии с прилагаемой инструкцией. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 2000 см³ и доводят дистиллированной водой до метки.

 

6.3.4.2 Определение коэффициента поправки к номинальной концентрации раствора серной кислоты c (H₂SO₄) = 0,05 моль/дм³ проводят по ГОСТ 25794.1 (пункт 2.1.3).

6.3.5 Приготовление индикатора Таширо

2 г метилового красного и 1 г метиленового голубого растворяют в 1000 см³ 96%-ного этилового спирта.

Изменение окраски индикатора происходит при pH = 5,4 ед. pH.

Раствор хранят в склянке из темного стекла.

6.4 Проведение анализа

6.4.1 Анализ необходимо проводить в лаборатории, свободной от паров аммиака.

6.4.2 В колбу Кьельдаля помещают примерно 15 г безводного сульфата калия и 0,5 г сульфата меди.

6.4.3 На кусочек беззольной фильтровальной бумаги отвешивают около 2 г подготовленной пробы с точностью до 0,001 г и осторожно помещают в колбу Кьельдаля.

Для проб с большой массовой долей жира масса пробы не должна превышать 1,5 г.

6.4.4 В колбу Кьельдаля добавляют 25 см³ серной кислоты. Содержимое колбы осторожно перемешивают, слегка вращая колбу с жидкостью. При необходимости можно вставить грушевидный стеклянный конус в горловину колбы тонким концом вниз.

6.4.5 Колбу помещают в наклонном положении под углом около 40° относительно вертикального положения на нагревательное устройство. Сначала колбу осторожно нагревают до появления пенообразования и до полного растворения пробы.

Затем продолжают минерализацию при энергичном кипении, время от времени поворачивая колбу до тех пор, пока жидкость не станет абсолютно прозрачной и не приобретет светлую зелено-голубую окраску. После полного осветления содержимого колбы продолжают кипячение еще в течение 90 мин.

Общая продолжительность минерализации должна быть не менее 2 ч.

Во избежание потерь азота во время минерализации пробы следует избегать попадания содержимого колбы на наружную поверхность колбы, не допускать чрезмерного улетучивания серной кислоты в результате перегрева во время минерализации, так как это может вызвать потерю азота.

6.4.6 Колбу Кьельдаля с содержимым охлаждают до температуры 40 °C, осторожно добавляют 50 см³ дистиллированной воды, перемешивают и охлаждают до комнатной температуры.

6.4.7 Содержимое колбы Кьельдаля подвергают перегонке с водяным паром или простой перегонке, для чего монтируют соответствующую установку.

В стадии перегонки следует соблюдать плотность установки для перегонки, добавлять раствор гидроокиси натрия по стенке колбы Кьельдаля и смешивать оба слоя только после подключения колбы к установке.

В качестве приемника применяют коническую колбу вместимостью 500 см³, в которую наливают 50 см³ раствора борной кислоты и четыре капли индикатора Таширо. Колбу помещают под холодильник установки для перегонки таким образом, чтобы нижний конец холодильника был полностью погружен в жидкость.

Примечание - При применении титратора в качестве приемника используют химический стакан вместимостью 500 см³.

 

6.4.8 Для перегонки с водяным паром содержимое колбы Кьельдаля количественно переносят в колбу для перегонки, споласкивая колбу Кьельдаля 50 см³ дистиллированной воды. Затем добавляют три капли парафинового масла с целью уменьшения пенообразования, осторожно добавляют 100 см³ раствора гидроокиси натрия таким образом, чтобы в колбе для перегонки образовались два слоя жидкости. Немедленно герметизируют аппарат и пропускают водяной пар через содержимое колбы для перегонки. С момента кипения содержимого колбы продолжают обогрев в течение 20 мин. Заканчивают перегонку после получения не менее 150 см³ дистиллята.

6.4.9 Для простой перегонки осторожно разбавляют содержимое колбы Кьельдаля, добавляя 300 см³ дистиллированной воды, перемешивают и охлаждают до комнатной температуры, добавляют несколько карборундовых бус или кусков пемзы и три капли парафинового масла. Затем добавляют 100 см³ раствора гидроокиси натрия таким образом, чтобы он образовал отдельный слой на дне колбы Кьельдаля, и немедленно подключают колбу к установке для перегонки. Перегонку заканчивают после получения не менее 150 см³ дистиллята.

6.4.10 После сбора не менее 150 см³ дистиллята, полученного после перегонки, коническую колбу (приемник) опускают таким образом, чтобы нижний конец холодильника находился над уровнем дистиллята, споласкивают конец холодильника водой и проверяют при помощи лакмусовой бумажки или универсального индикатора изменение окраски конденсата, стекающего из холодильника. При отсутствии изменений окраски перегонку заканчивают.

6.4.11 Содержимое конической колбы (приемника) титруют раствором соляной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм³ или раствором серной кислоты молярной концентрации 0,05 моль/дм³ с помощью бюретки и отмечают с погрешностью не более 0,02 см³ количество израсходованного раствора кислоты.

6.4.12 При применении титратора вместо конических колб в качестве приемника используют химические стаканы и после окончания перегонки помещают их в титратор, поступая согласно инструкции по обслуживанию аппарата.

6.4.13 Полученные результаты титрования используют для вычисления массовой доли общего азота и последующего пересчета на белок.

6.4.14 Одновременно проводят контрольный опыт, помещая в контрольную колбу Кьельдаля вместо испытуемой пробы кусочек беззольной фильтровальной бумаги. Всегда проводят контрольный опыт (дважды), когда используются свежеприготовленные растворы.

6.4.15 При получении сомнительных результатов (слишком низких или с большими расхождениями между параллельными испытаниями) необходимо провести проверку установки для перегонки или процедуры минерализации.

Для проверки установки для перегонки в аппарат помещают, например, 0,5, 0,7 или 0,8 г сульфата аммония с содержанием основного вещества 99,5% (содержание азота составляет 21,179%), добавляют 25 см³ концентрированной серной кислоты, перегоняют и титруют. Низкий результат (менее 19,061% азота) может указать на неполную перегонку или негерметичность аппарата.

Для проверки всего процесса с неорганическим веществом используют сульфат аммония и проводят все испытания, как указано в 6.4.2 - 6.4.11.

Низкий результат, который не может быть приписан процессу перегонки, может быть вызван потерями во время испытаний (выплескивание жидкости, улетучивание соединений азота и т.д.).

Для проверки всего процесса с учетом разложения органического вещества определяют массовую долю азота в органическом трудно разлагаемом соединении (например, в триптофане), чистом или смешанном с веществами, не содержащими азот.

Низкий результат (менее 19,061% азота) может быть получен из-за недостаточного разложения органического вещества, например, вследствие неправильного обогрева или применения несоответствующего катализатора.

6.5 Обработка результатов

6.5.1 Массовую долю белка X, %, вычисляют по формуле

 

(1)

 

где 0,0014 - количество азота, эквивалентное 1 см³ 0,1 моль/дм³ раствора соляной кислоты или 0,05 моль/дм³ раствора серной кислоты, г;

V₁ - объем 0,1 моль/дм³ раствора соляной кислоты или объем 0,05 моль/дм³, израсходованный на титрование исследуемой пробы, см³;

V₂ - объем 0,1 моль/дм³ раствора соляной кислоты или объем 0,05 моль/дм³, израсходованный на титрование контрольной пробы, см³;

K - коэффициент поправки к номинальной концентрации раствора соляной кислоты;

100 - коэффициент пересчета в проценты;

m - масса пробы, г;

6,25 - коэффициент пересчета на белок.

6.5.2 За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение двух параллельных определений, округленное до второго десятичного знака, если удовлетворяются условия повторяемости (сходимости).