ГОСТ 25011-2017. Межгосударственный стандарт. Мясо и мясные продукты. Методы определения белка

7. Спектрофотометрический метод определения

массовой доли белка

 

7.1 Сущность метода

Метод основан на минерализации пробы по Кьельдалю и спектрофотометрическом измерении интенсивности окраски индофенолового синего, которая пропорциональна количеству аммиака в минерализате.

7.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы и реактивы

Мясорубка механическая по ГОСТ 4025 или электрическая по ГОСТ 20469 с решеткой, диаметр отверстий которой не более 4,5 мм, или гомогенизатор.

Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 специального или высокого класса точности с пределом допускаемой абсолютной погрешности не более +/- 0,001 г.

Холодильник по ГОСТ 26678.

Спектрофотометр или фотоэлектроколориметр со светофильтром, обеспечивающий измерение при длине волны (625 +/- 2) нм, укомплектованный стеклянными кюветами с длиной рабочей грани 10 мм.

Часы электронно-механические по ГОСТ 26272.

Колбы мерные 1-100-2 или 2-100-2, 1-250-2 или 2-250-2, 1-500-2 или 2-500-2, 1-1000-2 или 2-1000-2 по ГОСТ 1770.

Колбы Кьельдаля 1-50-14/23 ТС или 1-100-14/23 ТС, 2-50-14 ТХС или 2-100-14 ТХС по ГОСТ 25336.

Пробирки П 4-15-14/23 ХС или П 4-20-14/23 ХС по ГОСТ 25336.

Колбы Кн-1-100-14/23 по ГОСТ 25336.

Цилиндры 1-25, 1-50, 1-100, 1-500 по ГОСТ 1770.

Пипетки 1-1-1-1 или 1-2-1-1, 1-1-1-5 или 1-2-1-5, 1-1-1-10 или 1-1-2-10 по ГОСТ 29227.

Пипетки 1-2-1 или 2-2-1, 1-2-5 или 2-2-5, 1-2-10 или 2-2-10 по ГОСТ 29169.

Стаканы В-1-600 ТХС или Н-1-600 ТХС по ГОСТ 25336.

Воронки В-56-80 ХС или В-75-110 ХС по ГОСТ 25336.

Стаканчики для взвешивания (бюксы) СВ-14/8 по ГОСТ 25336.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или вода для лабораторного анализа по ГОСТ ISO 3696, степень чистоты 1.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч.

Натрий углекислый по ГОСТ 83, х.ч.

Известь хлорная по ГОСТ 1692, х.ч.

Кислота серная по ГОСТ 4204, х.ч.

Натрий серноватистокислый (тиосульфат натрия) по ГОСТ 27068, х.ч.

Водорода перекись по ГОСТ 10929, х.ч.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, ч.д.а.

Аммоний сернокислый по ГОСТ 3769, х.ч.

Фенол, ч.

Натрий нитропруссидный, ч.

Натрия гипохлорит по ГОСТ 11086.

Натрия дихлоризоцианурат.

Калий йодистый по ГОСТ 4232, х.ч.

Калий сернокислый по ГОСТ 4145, х.ч.

Стандарт-титр (фиксанал) для приготовления раствора серноватистокислого натрия (тиосульфата натрия) молярной концентрации 0,1 моль/дм³.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и вспомогательного оборудования с техническими характеристиками не ниже, а также материалов и реактивов по качеству не ниже указанных в настоящем стандарте.

7.3 Подготовка к анализу

7.3.1 Приготовление реактива 1

10 г фенола и 0,05 г нитропруссида натрия растворяют в 200 - 300 см³ дистиллированной воды, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см³, доводят объем дистиллированной водой до метки и перемешивают.

Реактив хранят в склянке из темного стекла в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C не более 2 мес.

7.3.2 Приготовление реактива 2

5 г гидроокиси натрия растворяют в 100 - 150 см³ дистиллированной воды, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см³, после охлаждения добавляют количество исходного раствора гипохлорита натрия из расчета его содержания 0,42 г/дм³ или 0,2 г дихлоризоцианурата натрия, доводят объем колбы дистиллированной водой до метки и перемешивают.

Реактив хранят в склянке из темного стекла в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C не более 2 мес.

Примечание - Перед приготовлением реактива 2 необходимо определить содержание гипохлорита натрия в исходном растворе, учитывая неустойчивость его при хранении.

 

7.3.3 Приготовление раствора серноватистокислого натрия (тиосульфата натрия) молярной концентрации c (Na₂S₂O₃·5H₂O) = 0,1 моль/дм³

7.3.3.1 Раствор серноватистокислого натрия (тиосульфата натрия) молярной концентрации 0,1 моль/дм³ готовят по ГОСТ 25794.2 (пункт 2.11).

Примечание - Допускается приготовление раствора серноватистокислого натрия (тиосульфата) натрия молярной концентрации 0,1 моль/дм³ из стандарт-титра (фиксанала) в соответствии с прилагаемой инструкцией.

 

Раствор хранят в склянке из темного стекла при температуре (20 +/- 2) °C не более 1 мес.

7.3.3.2 Определение коэффициента поправки к номинальной концентрации раствора серноватистокислого натрия c (Na₂S₂O₃) = 0,1 моль/дм³ проводят по ГОСТ 25794.2 (пункт 2.11.3).

7.3.4 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации c (HCl) = 1 моль/дм³

Раствор соляной кислоты молярной концентрации 1 моль/дм³ готовят по ГОСТ 25794.1 (пункт 2.1.2).

7.3.5 Приготовление исходного раствора гипохлорита натрия

7.3.5.1 Раствор 1

В стакане вместимостью 500 см³ перемешивают 150 г хлорной извести с 250 см³ дистиллированной воды.

7.3.5.2 Раствор 2

В стакане вместимостью 600 см³ в 250 см³ дистиллированной воды растворяют 150 г углекислого натрия.

7.3.5.3 Исходный раствор гипохлорита натрия

К раствору 1 при постоянном перемешивании приливают раствор 2.

Масса сначала густеет, затем разжижается. Полученную суспензию оставляют на 24 - 48 ч для отстаивания, затем надосадочную жидкость сливают и отфильтровывают.

Полученный реактив имеет концентрацию активного хлора около 60 - 100 г/дм³ и может храниться в склянке из темного стекла до одного года.

7.3.5.4 В полученном реактиве определяют концентрацию активного хлора.

Для этого 1 см³ прозрачного фильтрата вносят в коническую колбу вместимостью 100 см³, добавляют 40 - 50 см³ дистиллированной воды, прибавляют 2 г йодистого калия и 10 см³ раствора соляной кислоты молярной концентрации 1 моль/дм³. Образовавшийся йод оттитровывают 0,1 моль/дм³ раствором серноватистокислого натрия до исчезновения вишневой окраски (1 см³ 0,1 моль/дм³ раствора серноватистокислого натрия соответствует 0,00355 г хлора).

По количеству израсходованного на титрование раствора серноватистокислого натрия определяют количество раствора гипохлорита натрия, необходимого для приготовления реактива 2.

Пример расчета - Количество 0,1 моль/дм³ раствора серноватистокислого натрия, израсходованного на титрование 1 см³ исходного раствора гипохлорита натрия, составляет, например, 12,1 см³.

Эквивалентная масса гипохлорита натрия равна половине молекулярной массы гипохлорита натрия и составляет 74,4:2 = 37,2 г. Следовательно, количество гипохлорита натрия в исходном растворе гипохлорита натрия составляет 1,21·37,2 = 45,01 г.

Учитывая, что реактив 2 должен содержать 0,42 г гипохлорита натрия, из пропорции определяем:

в 1000 см³ исходного раствора - 45,01 г

 

X - 0,42 г.

 

 

Следовательно, для приготовления 1 дм³ реактива 2 требуется 9,3 см³ исходного раствора гипохлорита натрия.

7.3.6 Приготовление стандартного раствора сернокислого аммония

0,236 г сернокислого аммония, предварительно высушенного до постоянной массы при температуре 60 °C, растворяют в 100 - 150 см³ дистиллированной воды, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 500 см³ и доводят объем дистиллированной водой до метки.

Раствор содержит 0,1 мг азота в 1 см³.

7.3.7 Приготовление рабочих растворов сернокислого аммония

В мерные колбы вместимостью 100 см³ вносят пипеткой следующие количества стандартного раствора в см³: 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0. Доводят объемы колб дистиллированной водой до метки и перемешивают. Получают серию рабочих растворов. Полученные рабочие растворы содержат в 1 см³ соответственно 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 мкг азота.

Готовят три серии рабочих растворов, начиная каждый раз с приготовления стандартного раствора сернокислого аммония из нового сернокислого аммония.

7.3.8 Построение градуировочного графика

7.3.8.1 Для проведения цветной реакции в пробирки вносят по 1 см³ рабочего раствора, добавляют 5 см³ реактива 1 и 5 см³ реактива 2 и перемешивают.

Одновременно проводят контрольный опыт. Для этого в пробирку вместо рабочего раствора вносят 1 см³ дистиллированной воды.

7.3.8.2 Через 30 мин измеряют величину оптической плотности на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре при длине волны (625 +/- 2) нм в стеклянной кювете с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм в отношении контрольного опыта.

7.3.8.3 По полученным средним данным измерений из трех стандартных растворов строят градуировочный график. На оси абсцисс откладывают концентрацию сернокислого аммония (мкг в 1 см³ окрашенного раствора), на оси ординат - соответствующее значение оптической плотности (D). Градуировочный график должен проходить через начало координат.

7.4 Проведение анализа

7.4.1 На кусочек беззольной фильтровальной бумаги отвешивают около 2 г подготовленной пробы с точностью до 0,001 г и осторожно помещают в колбу Кьельдаля.

Для проб с большой массовой долей жира масса пробы не должна превышать 1,5 г.

7.4.2 Одновременно проводят контрольный опыт, помещая в контрольную колбу Кьельдаля вместо испытуемой пробы кусочек беззольной фильтровальной бумаги.

7.4.3 В обе колбы добавляют 10 см³ концентрированной серной кислоты, 1 - 2 г сернокислого калия и проводят минерализацию, периодически добавляя для интенсивности процесса в охлажденную колбу перекись водорода (5 - 7 см³ в течение всей минерализации). Допускается применение других катализаторов, обеспечивающих точность определения.

7.4.4 После минерализации колбы охлаждают и содержимое количественно переносят в мерные колбы вместимостью 250 см³, после охлаждения объем доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

7.4.5 В мерную колбу вместимостью 100 см³ переносят 5 см³ полученного минерализата и доводят объем до метки дистиллированной водой.

7.4.6 Для проведения цветной реакции 1 см³ разбавленного минерализата вносят в пробирку, затем последовательно добавляют 5 см³ реактива 1 и 5 см³ реактива 2, и перемешивают содержимое пробирки.

Через 30 мин измеряют оптическую плотность растворов относительно контрольного раствора на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре при длине волны (625 +/- 2) нм в стеклянной кювете с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм.

Контрольный раствор готовят одновременно, используя для этой цели контрольный минерализат.

Стабильность окраски растворов сохраняется в течение 1 ч.

7.4.7 По полученному значению оптической плотности с помощью градуировочного графика находят концентрацию азота.

7.5 Обработка результатов

7.5.1 Массовую долю белка X, %, вычисляют по формуле

 

(2)

 

где c - концентрация азота, найденная по градуировочному графику, мкг/см³;

250 - объем минерализата после первого разведения, см³;

100 - объем минерализата после вторичного разведения, см³;

100 - коэффициент пересчета в проценты;

m - масса пробы, г;

5 - объем разбавленного минерализата, взятый для вторичного разведения, см³;

1 - объем раствора, взятый для проведения цветной реакции, см³;

10⁶ - коэффициент перевода г в мкг;

6,25 - коэффициент пересчета на белок.

7.5.2 За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение двух параллельных определений, округленное до второго десятичного знака, если удовлетворяются условия повторяемости (сходимости).