ГОСТ 34104-2017. Межгосударственный стандарт. Корма и кормовые добавки. Метод идентификации генетически модифицированных линий сои, кукурузы и рапса с использованием ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени

9 Постановка ПЦР и проведение амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR)

9.1 Приготовление реакционной ПЦР-смеси

Для приготовления реакционной ПЦР-смеси для определения генетически модифицированной линии сои, кукурузы или рапса берут 1 мм³ деионизированной воды, по 1 мм³ каждого соответствующего праймера с маркировкой "F" по 5.3.2 концентрацией 5·10^-6 моль/дм³, по 1 мм³ каждого праймера с маркировкой "R" по 5.3.2 концентрацией 5·10^-6 моль/дм³, по 1 мм³ каждого зонда с маркировкой "P" по 5.3.2 концентрацией 3·10^-6 моль/дм³, 3 мм³ раствора дНТФ и смешивают в пробирке вместимостью 1,5 см³. Срок хранения готовой ПЦР-смеси при температуре не выше минус 18 °C - не более 12 мес.

9.2 Постановка ПЦР

9.2.1 ДНК, экстрагированную из анализируемой пробы (включая стандартные образцы), испытывают не менее чем в двух повторностях.

9.2.2 Для проведения ПЦР в одной пробирке смешивают 10 мм³ ПЦР-смеси по 9.1, к которой добавляют 5 мм³ ПЦР-буфера и 0,5 мм³ термостабильной Taq полимеразы. Смесь перемешивают на встряхивателе, осаждая кратковременным центрифугированием.

9.2.3 Вносят по 15 мм³ смеси, полученной по 9.2.2, в микропробирку вместимостью 0,2 см³, затем, используя наконечник с аэрозольным барьером, добавляют в нее 10 мм³ ДНК, полученной из анализируемой пробы (ДНК-проба) в соответствии с разделом 8. Общий объем реакционной смеси - 25 мм³.

Примечание - Необходимо избегать попадания сорбента в реакционную смесь.

9.3 Контрольные реакции амплификации:

- отрицательный контроль ПЦР (К-) - вместо ДНК-пробы в микропробирку с 15 мм³ смеси по 9.2.2 вносят 10 мм³ TE-буфера;

- положительный контроль ПЦР (К+) - вместо ДНК-пробы в микропробирку с 15 мм³ смеси по 9.2.2 вносят 10 мм³ 1%-ного стандартного образца состава ГМ сои, ГМ кукурузы или ГМ рапса.

9.4 Проведение амплификации и детекции флуоресцентного сигнала

Программируют прибор для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

Программы амплификации для идентификации линий ГМ сои, кукурузы и рапса различаются для разных ГМ линий и приведены в таблицах 4 - 11.

Программа амплификации для идентификации ГМ сои линий 40-3-2, A5547-127, A2704-12 приведена в таблице 4.

Таблица 4