ГОСТ 34104-2017. Межгосударственный стандарт. Корма и кормовые добавки. Метод идентификации генетически модифицированных линий сои, кукурузы и рапса с использованием ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени

8 Экстракция ДНК

 

8.1 Экстракцию ДНК из анализируемой пробы осуществляют с использованием набора реагентов для экстракции ДНК сорбционным методом по 5.3 или иным методом, позволяющим получить достаточный объем ДНК для последующих исследований. Объем ДНК, необходимый для проведения исследований, вычисляют по формулам:

 

V_и = 10·N, (1)

 

где V_и - объем ДНК, необходимый для проведения идентификации линий;

N - количество идентифицируемых линий;

 

V_к = 10·2N, (2)

 

где V_к - объем ДНК, необходимый для проведения количественного анализа.

8.2 Буфер для лизирующего реагента и раствор для отмывки N 1 (если они хранились при температуре от 2 °C до 8 °C) прогревают на поверхности твердотельного термостата при температуре от 60 °C до 64 °C до полного растворения кристаллов.

8.3 Отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 см³ (включая отрицательный контроль выделения). В пробирки вносят анализируемые пробы. В пробирку отрицательного контроля выделения ДНК вносят 100 мм³ ОКО.

8.4 Отдельными наконечниками с аэрозольным барьером вносят в каждую пробирку по 400 мм³ буфера для лизирующего реагента и по 17 мм³ лизирующего реагента. Тщательно перемешивают содержимое пробирок на встряхивателе в течение 10 с.

8.5 Пробирки инкубируют в термостате при температуре 64 °C в течение 1 ч, периодически встряхивая на встряхивателе (пять раз через каждые 10 - 12 мин).

8.6 Нерастворенные частицы анализируемой пробы осаждают центрифугированием при 12 - 14 тыс. об/мин в течение 5 мин.

8.7 Надосадочную жидкость в объеме 200 - 350 мм³ очень аккуратно (так, чтобы не попали взвешенные частицы и капли жира) отбирают отдельными наконечниками с аэрозольными барьерами и переносят в новые пробирки.

8.8 Пробирки с надосадочной жидкостью прогревают в течение 5 мин в термостате при температуре 64 °C, перемешивают содержимое пробирок и центрифугируют в течение 5 с при 5 тыс. об/мин для сброса капель с крышки пробирки.

8.9 В каждую пробирку отдельным наконечником добавляют по 25 мм³ сорбента, предварительно помещенного во встряхиватель для получения однородной суспензии. Содержимое пробирок перемешивают на встряхивателе и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 - 15 мин, перемешивая через каждые 2 мин. Сорбент осаждают центрифугированием при 5 тыс. об/мин в течение 30 с. Надосадочную жидкость удаляют, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.

8.10 В пробирки добавляют по 300 мм³ раствора для отмывки N 1. Перемешивают на встряхивателе до полного ресуспендирования сорбента. Сорбент осаждают центрифугированием при 5 тыс. об/мин в течение 30 с. Удаляют надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.

8.11 Процедуру отмывки повторяют дважды, используя по 500 мм³ раствора для отмывки N 2, и центрифугируют в течение 30 с при 7 тыс. об/мин, удаляют надосадочную жидкость полностью.

8.12 Пробирки с отмытым сорбентом помещают в термостат при температуре 64 °C на 10 мин для подсушивания сорбента. При этом крышки пробирок должны быть открыты.

8.13 В пробирки добавляют по 50 мм³ буфера для элюции ДНК и перемешивают на встряхивателе. Помещают в термостат при температуре 64 °C на 5 мин и периодически (один раз в минуту) встряхивают на встряхивателе. Пробирки центрифугируют при 12 тыс. об/мин в течение 1 мин.

8.14 Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК, которую затем используют для постановки ПЦР и проведения амплификации. Очищенную ДНК можно хранить в течение одной недели при температуре от 2 °C до 8 °C и в течение года при температуре не выше минус 16 °C. Для этого рекомендуется перенести надосадочную жидкость в чистую микропробирку.