ГОСТ ISO 11133-2016. Межгосударственный стандарт. Микробиология пищевых продуктов, кормов для животных и воды. Приготовление, производство, хранение и определение рабочих характеристик питательных сред
8. Методы эксплуатационных испытаний жидких питательных сред
8.1 Общие положения
Настоящий раздел описывает количественные и качественные методы эксплуатационных испытаний жидких питательных сред. Блок-схема каждого метода приведена в приложении C.
8.2 Количественный метод эксплуатационных испытаний жидких питательных сред с использованием пробирок (метод разведения до нулевого уровня)
8.2.1 Общие положения
Настоящий метод является основным методом, который допускается использовать для неселективной или селективной жидкой среды. Он также пригоден для проведения эксплуатационных испытаний жидких сред, используемых для подсчета, например, в методах наиболее вероятного числа.
8.2.2 Приготовление серии разведений
- Выбирают репрезентативное количество пробирок (см. 6.3.1).
- Готовят подходящую серию разведений из рабочей культуры целевых или нецелевых микроорганизмов в подходящем разбавителе, как это описано в ISO 6887-1 и ISO 8199, так, чтобы в наибольшем разведении (нулевой уровень) микроорганизмы отсутствовали (например, от 10-1 до 10-10). Наиболее часто используют серию десятичных разведений, тем не менее серии разведений с шагом 1/5 или 1/2 также являются пригодными.
- Серию разведений используют в течение установленного времени (см. 5.4.2.3).
- В течение времени выполнения работы переносят заданный объем (например, 0,1 см3 каждого разведения) на поверхность неселективной агаровой среды и распределяют по поверхности.
- Инкубируют в заданных условиях с целью обеспечения роста конкретного микроорганизма.
- Проводят подсчет количества колоний на поверхности агаровой среды для наименьшего разведения, содержащей не более 150 колоний, а также количество колоний для последующих разведений; результаты записывают.
8.2.3 Методика испытания жидкой среды
- Отбирают количество пробирок с испытуемой средой, соответствующее количеству пробирок серии разведений.
- Используя разведения, приготовленные по 8.2.2 и начиная с наибольшего разведения, инокулируют заданный объем суспензии тест-микроорганизма (например, 0,1 см3) в соответствующую пробирку со средой.
- Пробирки инкубируют в условиях, установленных в соответствующем стандарте (см. 5.4.2.6).
- После инкубирования при помощи петли, удерживающей объем материала 10 мм3, пересевают материал каждой пробирки с инкубированной средой (при этом каждый раз используют новую петлю) на неселективную агаровую среду.
- Инокулированные слои инкубируют в условиях, обеспечивающих эффективный рост микроорганизмов.
- После инкубирования исследуют каждый посев на наличие или отсутствие роста.
Примечание - Для целевых микроорганизмов, как правило, достаточно использовать разведения от 10-5 до 10-8. Для нецелевых микроорганизмов, как правило, достаточными являются разведения от 10-1 до 10-4.
8.2.4 Вычисления и интерпретация результатов
Производительность жидкой обогатительной среды является удовлетворительной, если наблюдается выраженный рост целевого микроорганизма (не менее 10 КОЕ из 10 мм3 материала петли) из разведений, которые позволяют получить менее 100 КОЕ при посеве 100 мм3 на поверхность среды.
Для селективных жидких сред определяют коэффициент селективности SF на основе наибольшего разведения рабочей культуры, демонстрирующего выраженный рост (не менее 10 КОЕ) на слое агара, и наибольшего разведения инокулированной селективной жидкой среды, демонстрирующей отсутствие роста (или рост менее 10 КОЕ) нецелевого микроорганизма на неселективном агаровом слое. Значение SF должно быть не менее 2.
Примечание - Дополнительные методы количественного испытания жидких сред применительно к оценке разрабатываемых сред или в сравнительных исследованиях приведены в приложении I.
8.3 Качественный метод эксплуатационных испытаний жидких селективных питательных сред с использованием пробирок
8.3.1 Общие положения
В данном методе используют целевые, нецелевые либо смесь целевых и нецелевых микроорганизмов в одной пробирке.
8.3.2 Методика
- Отбирают количество пробирок, каждая из которых содержит 10 см3 среды или 10 см3 порции из каждой партии для испытаний (см. 3.1.2 и 6.3.1). Действуют в соответствии с процедурой, описанной ниже, в соответствии с требованиями, установленными в приложениях E и F.
- Приготовление инокулятов см. 5.4.2.3.
- Инокуляция целевым микроорганизмом: инокулируют одну пробирку испытуемого бульона инокулятом, содержащим <= 100 КОЕ целевого микроорганизма, и перемешивают.
- Инокуляция нецелевым микроорганизмом: инокулируют одну пробирку испытуемого бульона одним микроорганизмом при помощи инокулята с высокой концентрацией микроорганизма (>= 1000 КОЕ) и перемешивают.
- Инокуляция целевым и нецелевым микроорганизмами в одной пробирке, когда это требуется в соответствии с приложениями E и F или когда проводят оценку новой среды или нового изготовителя: инокулируют одну пробирку испытуемого бульона целевым микроорганизмом в количестве <= 100 клеток и большим количеством нецелевых микроорганизмов (>= 1000 клеток на каждую пробирку) и перемешивают.
- Пробирки инкубируют в условиях, установленных в конкретных стандартах (см. 5.4.2.6).
- Отбирают петлей материал (приблизительно 10 мм3) из пробирки, содержащей целевой микроорганизм, и проводят посев штрихом на слое неселективной среды (например, TSA).
- При использовании смешанной культуры целевого и нецелевых микроорганизмов отбирают петлей материал (приблизительно 10 мм3) и проводят посев штрихом на слое среды, специфичной для целевого микроорганизма.
- Отбирают петлей материал (приблизительно 10 мм3) культуры нецелевого микроорганизма и проводят посев штрихом на поверхность селективной среды (например, XLD).
- Посевы инкубируют в условиях, установленных в конкретных международных стандартах.
При использовании больших объемов среды пользователь может принять решение о пропорциональном увеличении размера инокулята с тем, чтобы были получены эквивалентные результаты.
8.3.3 Вычисления и интерпретация результатов
Производительность испытуемого жидкого бульона является удовлетворительной, если наблюдается выраженный рост (не менее 10 КОЕ или линия сплошного роста) целевого микроорганизма на среде, специфичной для данного микроорганизма.
Селективность испытуемого жидкого бульона является удовлетворительной, если наблюдается отсутствие роста (или менее 10 КОЕ) нецелевых микроорганизмов на поверхности неселективной агаровой среды.
8.4 Качественный метод эксплуатационных испытаний жидких сред с использованием одной пробирки (определение мутности)
8.4.1 Общие положения
Настоящий метод пригоден для эксплуатационных испытаний неселективных жидких питательных сред и селективных сред, используемых для испытаний с подтверждением (например, бульона с бриллиантовым зеленым, желчью и лактозой [BGBLB], см. [41]). Метод является чисто качественным, и подсчитанные баллы являются только ориентировочными. По сути, мутные среды могут тестироваться данным методом, если только с них пересевают на плотную среду с тем, чтобы продемонстрировать наличие роста.
Для прозрачных сред использована следующая градация:
- 0 соответствует отсутствию мутности;
- 1 соответствует незначительной мутности;
- 2 соответствует выраженной мутности.
8.4.2 Методика
8.4.2.1 Среда предварительного обогащения
- Отбирают количество пробирок, каждая из которых содержит 10 см3 среды или 10 см3 порции каждой испытуемой партии (см. 3.1.2 и 6.3.1).
- При эксплуатационных испытаниях среды предварительного обогащения, например буферной пептонной воды (BPW), инокулируют среду подходящим объемом инокулята (см. конкретный стандарт), содержащим <= 100 КОЕ, добавляя инокулят непосредственно в испытуемую среду.
- Приготовление инокулятов см. 5.4.2.3.
- Пробирку инкубируют в условиях, установленных в конкретном стандарте (см. 5.4.2.6).
- Исследуют среду на наличие роста микроорганизмов.
8.4.2.2 Подтверждающая среда
- При эксплуатационных испытаниях жидкой подтверждающей среды испытуемую среду инокулируют суспензией рабочей культуры (содержащей > 106 КОЕ/см3) при помощи петли, позволяющей отбирать 1 мм3 материала.
- Пробирку инкубируют в условиях, установленных в конкретных стандартах (см. 5.4.2.6).
- Если неинокулированная среда изначально мутная, проводят пересев на плотную среду, инкубируют слои в условиях, установленных в конкретных стандартах, и исследуют среду на наличие роста.
8.4.3 Интерпретация результатов
- Качественную оценку проводят визуально, наблюдая выраженную мутность (т.е. на уровне 2), что соответствует выраженному росту (см. 8.4.1). Качественную оценку непрозрачных сред при приготовлении проводят, наблюдая рост на плотной среде.
Примечания
1 В некоторых случаях рост микроорганизмов можно наблюдать только как агрегацию клеток или образование осадка из клеток на дне пробирки или бутылки. В данном случае улучшить оценку и интерпретацию может тщательное встряхивание.
2 При помощи данного метода можно также определять другие характеристики, такие как газообразование или изменение цвета.
Подписаться на обновления