ГОСТ ISO/TS 22964-2013. Межгосударственный стандарт. Молоко и молочные продукты. Определение содержания Enterobacter sakazakii

9.5 Подтверждение

9.5.1 Образование желтого пигмента

9.5.1.1 Выбор колоний

Выбирают от одной до пяти типичных колоний презумптивных бактерий Enterobacter sakazakii на исследованной инкубированной чашке с хромогенной средой (см. 9.4).

9.5.1.2 Инкубация

Делают посев выбранных колоний (9.5.1.1) на поверхность чашек с TSA (см. 5.2.4.2) таким образом, чтобы после инкубации можно было наблюдать изолированные колонии. Инкубируют чашку при температуре (25 +/- 1) °C в течение 44 - 48 ч. После инкубации исследуют чашки с TSA на наличие колоний, содержащих желтые пигменты.

Если была выбрана только одна колония (см. 9.5.1.1) и ее пересеяли в чашку с TSA, а после инкубации не наблюдалось наличие колоний, содержащих желтый пигмент, то выбирают еще четыре типичные колонии (см. 9.5.1.1) и повторяют действия согласно 9.5.1.2 сначала. При наличии менее 5 типичных колоний следует выбрать все.

ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ - Некоторые редкие штаммы Enterobacter sakazakii не образуют желтый пигмент при условиях испытаний, описанных в настоящем стандарте, или пигмент может быть потерян в результате пересевов. Таким образом, подобные штаммы могут быть не распознаны как штаммы Enterobacter sakazakii при использовании данного метода.

9.5.2 Биохимическое подтверждение

9.5.2.1 Общие положения

Могут быть применены тест-системы для биохимической идентификации, которые в данный момент доступны в продаже и позволяют определить бактерии вида Enterobacter sakazakii.

9.5.2.2 Выбор колоний

Для дальнейшего биохимического анализа согласно 9.5.2.3 - 9.5.2.8 выбирают одну колонию, содержащую желтый пигмент, из каждой чашки с триптон-соевым агаром (см. 9.5.1.2).

9.5.2.3 Оксидаза

Используя стеклянную палочку или одноразовую иглу для посевов, отбирают часть из каждой выбранной характерной колонии (см. 9.5.2.2).

Наносят штрихи на фильтровальную бумагу, смоченную реактивом для определения оксидазы (см. 5.2.5.1), или на имеющийся в продаже диск. Не допускается использовать петлю или иглу, изготовленную из никеля/хрома.

Результат испытания считается отрицательным, если в течение 10 с фильтровальная бумага не поменяет цвет на сиреневый, фиолетовый или темно-синий.

9.5.2.4 L-лизиндекарбоксилаза

Используя петлю, иглу для посевов или стеклянную палочку, инокулируют среду на основе L-лизиндекарбоксилазы (см. 5.2.5.2) каждой из отобранных колоний (см. 9.5.2.2) чуть ниже поверхности жидкой среды. Инкубируют пробирки при температуре (30 +/- 1) °C в течение (24 +/- 2) ч.

Фиолетовый цвет после инкубации говорит о положительной реакции. Желтый цвет указывает на отрицательную реакцию.

9.5.2.5 L-орнитиндекарбоксилаза

Используя петлю, иглу для посевов или стеклянную палочку, инокулируют среду на основе L-орнитиндекарбоксилазы (см. 5.2.5.3) каждой из отобранных колоний (см. 9.5.2.2) чуть ниже поверхности жидкой среды. Инкубируют пробирки при температуре (30 +/- 1) °C в течение (24 +/- 2) ч.

9.5.2.6 L-аргининдигидролаза

Используя петлю, иглу для посевов или стеклянную палочку, инокулируют среду на основе L-аргининдигидролазы (см. 5.2.5.4) каждой из отобранных колоний (см. 9.5.2.2) чуть ниже поверхности жидкой среды. Инкубируют пробирки при температуре (30 +/- 1) °C в течение (24 +/- 2) ч.

9.5.2.7 Ферментация различных сахаров

Используя петлю, иглу для посевов или стеклянную палочку, инокулируют каждую среду для определения ферментации углеводов (см. 5.2.5.5.3) каждой из отобранных колоний (см. 9.5.2.2) чуть ниже поверхности жидкой среды. Инкубируют пробирки при температуре (30 +/- 1) °C в течение (24 +/- 2) ч.

Желтый цвет после инкубации говорит о положительной реакции. Красный цвет указывает на отрицательную реакцию.

9.5.2.8 Утилизация цитрата

Используя петлю, иглу для посевов или стеклянную палочку, делают посев отобранных колоний (см. 9.5.2.2) на скошенную поверхность цитратной среды Симмонса (см. 5.2.5.6). Инкубируют пробирки при температуре (30 +/- 1) °C в течение (24 +/- 2) ч.

Если питательная среда приобретает синий цвет, то реакция положительная.